High Resolution Size Exclusion Chromatography Analysis of Small Therapeutic Proteins

Význam tématu

Analýza malých terapeutických proteinů je klíčová pro zajištění jejich kvality a stability. Denaturace a agregace proteinů mohou negativně ovlivnit účinnost a bezpečnost léčivých přípravků. Velmi citlivá a reprodukovatelná metoda velikostně vylučovací chromatografie (SEC) umožňuje rychlou detekci monomerů, dimerů a vyšších agregátů, což je nezbytné pro vývoj a kontrolu biologických léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo porovnat výkonnost kolony Agilent AdvanceBio SEC 120 Å 1.9 µm s konkurenčními sub-2 µm SEC kolony při analýze rekombinantních proteinů: lidského růstového hormonu (hGH), faktoru stimulujícího granulocyty (hG-CSF) a interferonu α-2b (IFN α-2b). Studie zahrnovala i optimalizaci mobilní fáze pro co nejlepší rozlišení a tvar špiček.

Použitá metodika

Pro separaci byla zvolena reverzní velikostně vylučovací chromatografie s následujícími podmínkami:

• Kolona: AdvanceBio SEC 120 Å, 1.9 µm, 4.6 × 300 mm
• Mobilní fáze: 150 mM fosfátový pufr pH 7.0 (pro obecné separace), při optimalizaci pro IFN α-2b byl použit pufr se 200 mM fosfátu a 250 mM NaCl pH 6.5
• Průtok: 0.30–0.35 mL/min
• Teplota kolony: 25 °C
• Objem injekce: 2 µL (1 mg/mL) standardů i vzorků
• Doba analýzy: 15–20 min

Použitá instrumentace

Separace probíhala na systému Agilent 1260 Infinity II Bio-inert LC ovládaném softwarem OpenLab 2.2 CDS. Systém sestával z:

• Bio-inert pumpy Agilent 1260 Infinity II (G5654A)
• Bio-inert multisampleru s chlazením (G5668A, opce 100)
• Multikolonového termostatu s bio-inertní výměnou tepla (G7116A, opce 019)
• Diodového array detektoru WR (G7115A, opce 028)

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrace pomocí standardního mixu proteinů (1,700–44,000 Da) prokázala lineární závislost retenční doby na logaritmu molekulové hmotnosti, s pracovním rozsahem 1–80 kDa. AdvanceBio SEC ukázala nejvyšší rozlišení (USP Rs > 3.5) mezi monomerem a dimerem i mezi monomerem a nízkomolekulárními nečistotami. Ve srovnání s konkurenčními kolony vykázala nižší špičkování (t≤ 1.2) a ostré, úzké špičky.
Analýza hG-CSF na AdvanceBio SEC potvrdila přesnou detekci monomeru (~20 kDa) bez nežádoucích sekundárních interakcí. Podobně separace rekombinantního hGH (somatropinu) odhalila přítomnost dimerů a agregátů přímo v chromatogramu. Optimalizace NaCl koncentrace pro IFN α-2b (200–250 mM) vedla k nejlepšímu kompromisu mezi šířkou špičky (0.14 min) a rozlišením agregátů (Rs > 3.3).

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a reprodukovatelná separace monomerů, dimerů a agregátů proteinů
• Možnost pravidelné kalibrace a monitorování stavu kolony
• Včasná detekce problémů s mobilní fází či kolonnou, snížení prostojů
• Široké uplatnění v R&D, QA/QC a výrobě biotechnologických léčiv

Budoucí trendy a možnosti využití

Předpokládá se další rozvoj SEC materiálů s vylepšeným povrchovým potahem pro eliminaci nežádoucích interakcí a širším rozsahem pórů pro velké biologické makromolekuly. Integrace SEC s hmotnostní spektrometrií by umožnila detailní profilování posttranslačních modifikací. Automatizované kalibrace a monitorování výkonu kolony v reálném čase podpoří vyšší efektivitu laboratorních procesů.

Závěr

Agilent AdvanceBio SEC 120 Å 1.9 µm nabízí vysoké rozlišení, nízké špičkování a vynikající reprodukovatelnost při analýze malých terapeutických proteinů. Pravidelná kalibrace se standardy umožňuje přesné stanovení molekulové hmotnosti a včasnou diagnostiku provozních problémů, což zkracuje dobu neplánovaných odstávek a zvyšuje produktivitu.

Reference

1. Bayol A. a kol. Pharmeuropa Bio. 2004, 2004(1), 35–45.
2. Advani S. H. a kol. Indian J. Med. Paediatr. Oncol. 2010, 31(3), 79–82.
3. Sharma V. K.; Kalonia D. S. Pharmaceutical Research 2003, 20, 1721–1729.
4. Johnston M. J. W. a kol. Pharmaceutical Research 2011, 28, 1661–1667.