Improved Lifetime of Bio-Monolith Protein A Columns for Titer Determination

Význam tématu

Affinity chromatography with Protein A columns is a key technique for quantifying monoclonal antibody IgG concentrations directly in crude cell culture supernatants. Rapid titer determination supports clone screening, process optimization and harvest timing. Conventional packed columns often suffer from fouling and nonspecific binding when handling complex matrices, leading to reduced column lifetime and increased maintenance. Monolithic stationary phases offer enhanced robustness and minimal carryover for high-throughput analysis.

Cíle a přehled studie / článku

Tento příspěvek si klade za cíl demonstrovat prodlouženou životnost Bio-Monolith Protein A sloupců pro stanovení titru IgG bez nutnosti mezikroků čistění in-place (CIP). V práci jsou analyzovány kalibrace s různými množstvími lidského IgG ve zředěném supernatantu CHO buněk, testy přenosu a vyhodnocení stability chromatografických parametrů během několika set injekcí.

Použitá metodika

Vzorky: supernatant CHO buněk ředěný 1:3 v fosfátovém pufru, doplněný na finální koncentraci 5 mg/mL lidského IgG; prázdné vzorky stejného matriálu bez přídavku IgG byly použity ke kontrole nespecifického navázání a přenosu.
Chromatografické podmínky:

• Eluent A (vazebný): 50 mM NaH2PO4, pH 7,4
• Eluent B (eluční): 100 mM kyselina citronová, pH 2,6
• Gradient: 0–0,5 min 0 % B, 0,6–1,8 min 100 % B, 1,9–4,0 min 0 % B
• Průtok: 1 mL/min
• Teplota kolony: 24 °C
• Detekce: UV při 280 nm
• Objem injekcí: 2–40 µL podle potřeby

Použitá instrumentace

Agilent 1260 Infinity II Bio-inert LC sestava:

• Pumpa G5654A
• Multisampler G5668A s chladičem (option 100)
• Multicolumn termostat G7116A s výměníkem tepla (option 019)
• Diodový array detektor G7115A s bio-inertní detekční cely (option 028)

Řídicí software OpenLab 2.3 CDS.

Hlavní výsledky a diskuse

Byla vytvořena kalibrační křivka v rozsahu 10–150 µg IgG s lineárním vztahem mezi množstvím a plochou vrcholu až do saturace detektoru nad 200 µg. Při sérii 50 vzorků spíkovaných supernatantem následovaných blank injekcemi se nepotvrdil významný přenos (<0,2 %) a nevykázala se potřeba mezikroků CIP. Po více než 750 injekcích během čtyř dnů zůstala výška vrcholu, tvar a faktor tlačení stabilní bez znatelného zhoršení.

Přínosy a praktické využití metody

Tato metoda umožňuje vysokokapacitní, rychlé a spolehlivé stanovení IgG titru přímo z hrubých vzorků bez častého čištění sloupců. Je vhodná pro screening stovek vzorků, sledování bioprocesních podmínek a rozhodování o čase sklizně.

Budoucí trendy a možnosti využití

Potenciál pro integraci monolitických sloupců do 2D-LC nastavení, automatizované platformy a on-line monitorování procesních parametrů. Další rozvoj povrchových úprav monolitů a kombinace s hmotnostní detekcí pro komplexní bioanalytiku.

Závěr

Bio-Monolith Protein A sloupce prokázaly vynikající životnost a stabilitu při stanovení IgG titru z krutých buněčných supernatantů. Minimální nespecifické vazby, nízký přenos a zanedbatelná změna chromatografických parametrů i po stovkách injekcí z nich činí efektivní nástroj pro rychlé a spolehlivé analýzy.

Reference

1. Dumont E. et al. mAb Titer Analysis with the Agilent Bio-Monolith Protein A Column. Agilent Technologies application note, publ. 5991-5135EN, 2017.