mAb Titer Analysis with the Agilent Bio-Monolith Protein A Column

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAbs) představují klíčovou skupinu biologických léčiv pro léčbu širokého spektra onemocnění. V časné fázi vývoje je zásadní rychle a přesně stanovit koncentraci protilátky v kultivačních supernatantech buněk, což urychluje výběr nejproduktivnějších klonů a optimalizaci podmínek buněčné kultivace. Agilent Bio-Monolith Protein A kolona nabízí robustní a vysoce průtočnou platformu pro vysoce průkazné stanovení titru mAb bez nutnosti náročných předčistění.

Cíle a přehled studie / článku

Účelem studie bylo ověřit použitelnost monolitické Protein A kolony Agilent pro kvantitativní stanovení mAb titru přímo ze supernatantů CHO buněk. Byla hodnocena přesnost, linearita, citlivost, robustnost vůči carryover a možnosti optimalizace pufrů pro navazování a eluční krok. Studie ilustruje metodu na modelové protilátce trastuzumab (Herceptin) a jejím biosimiláru.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky kultivačního supernatantu byly naředěny 1:1 v 50 mM Na2HPO4 (pH 7,4) a odstředěny (5 000 g, 5 min). Jako standard sloužil komerční trastuzumab naředěný v pufru A.

Chromatografické podmínky:

• Kolona: Agilent Bio-Monolith Protein A 5,2 × 4,95 mm (p/n 5069-3639)
• Mobilní fáze A: 50 mM Na-fosfát, pH 7,4; B: 100 mM citrát + 2,6 mM octan, pH 2,8
• Gradient: 0–0,5 min 0 % B; 0,6–1,7 min 100 % B; 1,8–3,5 min 0 % B
• Průtok: 1 mL/min
• Teplota kolony: ambient
• Detekce: UV 280 nm
• Objem injekce: 5–50 µL (dle koncentrace)

Software: Agilent OpenLAB CDS ChemStation Rev. C01.05 (35).

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace pufrů pro navazování (pH 7–8) a eluční krok (citrát vs. octan) potvrdila, že 50 mM fosfát pH 7,4 pro navazování a 100 mM citrát pH 2,8 poskytují ostré a reprodukovatelné píky. Monolitická struktura dovoluje průtok nezávislý na difuzi, takže lze použít až 2 mL/min pro sub-dvouminutové analýzy.

Přesnost a opakovatelnost:

• RSD retenční doby: ~0,06 % (n=10)
• RSD plochy: 1,3–1,7 %
• Carryover při 5 µg naložení: nevýznamný

Citlivost (LOD): ~0,5 µg na kolonu; lineární rozsah plochy při injekcích 5–50 µL pro koncentrace 0,02–2 mg/mL (R2 ≥ 0,9996).

Aplikace na devět klonů CHO vyrábějících trastuzumab prokázala konzistentní stanovení titru (0,09–0,76 mg/mL) s výbornou korelací mezi citrátovou a octanovou eluční metodou.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlé, vysoce průkazné stanovení titru mAb bez předchozího vysoce výkonného čištění. Díky minimálnímu carryover a flexibilní injekční kapacitě lze zpracovat desítky vzorků za hodinu. Přímé stanovení titru z kultivačního média zjednodušuje workflow v laboratoři pro screening klonů a QA/QC bioprodukce.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace monolitických Protein A kolon do plně automatizovaných vysokopropustných platforem
Možnost přímého online propojení s hmotnostní spektrometrií pro detailní charakterizaci protilátek
Optimalizace pro nižší objemy vzorku a detekci stopových koncentrací díky citlivějším detektorům
Rozšíření aplikace na další imunoglobulinové třídy a biologické matrice (např. séra, dialyzáty)

Závěr

Agilent Bio-Monolith Protein A kolona představuje robustní, rychlou a přesnou metodu pro stanovení mAb titru v buněčných kultivačních supernatantech. Metoda nabízí široký lineární rozsah, výbornou reprodukovatelnost a minimální carryover. Díky jednoduché údržbě a možnosti čištění v místě (CIP) je vhodná pro rutinní i vývojová použití v biotechnologickém průmyslu.

Použitá instrumentace

• Agilent 1100 Series Quaternary Pump (G1311A)
• Agilent 1100 Series Autosampler (G1313A)
• Agilent 1100 Series Diode Array Detector (G1315A)
• Agilent Bio-Monolith Protein A kolona (p/n 5069-3639)
• Agilent OpenLAB CDS ChemStation Rev. C01.05