Bio-Monolith Protein G Column - More Options for mAb Titer Determination

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) jsou dnes klíčovými biopharma produkty díky své schopnosti cíleně neutralizovat patogeny a patologické procesy. Rychlé a spolehlivé stanovení titru protilátek v buněčných kulturách je nezbytné pro výběr výtěžných klonů a optimalizaci výrobního procesu. Agilent Bio-Monolith Protein G kolona nabízí vysokou selektivitu pro různé IgG podtřídy, včetně těch, které nejsou dobře zachycovány klasickými Protein A kolonami.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této aplikační studie je představit vlastnosti Agilent Bio-Monolith Protein G kolony a demonstrovat její použití pro kvantitativní a kvalitativní analýzu mAb z různých buněčných supernatantů a lyzátů. Studie hodnotí selektivitu vůči podtřídám IgG, lineární rozsah kvantifikace, kapacitu naložení, rychlost analýzy, kompatibilitu s různými eluciončními pufry, regenerovatelnost a dlouhodobou stabilitu.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza probíhala na Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC systému s UV detekcí při 280 nm. Kolona Bio-Monolith Protein G o rozměrech 5,2×4,95 mm byla použita pro afinitní separaci mAb ze vzorků:

• Mobilní fáze A: 50 mM fosfátový pufr, pH 7,4
• Mobilní fáze B: 0,1 M kyselina citronová, pH 2,0 (alternativně HCl, ocetová, glycin)
• Gradient: od 100 % A k 100 % B během 0,5 min, eluce 1,7–1,8 min
• Průtok: 1,0–2,5 mL/min při teplotě 25 °C

Hlavní výsledky a diskuse

Protein G kolona v porovnání s Protein A vykázala vyšší afinitu pro lidské IgG3 a obdobné pro IgG1 a IgG2. Host-cell proteiny z CHO, hmyzu i E. coli byly kompletně propuštěny v průtoku, bez nespecifické vazby. Kvantifikace mAb je lineární v rozsahu 2–200 µg, s korelačními koeficienty R² > 0,995. Maximální kapacita naložení dosahuje 400–500 µg IgG, což pokrývá potřeby výběru klonů i procesní výrobní kontroly. Zvýšení průtoku až na 2,5 mL/min zkracuje retenci při zachování konstantních relativních výtěžků. Tlakové poměry ukázaly lineární nárůst až do ~60 bar při 2,5 mL/min, přičemž běžný provoz probíhá pod 25 bar.

Regenerace po clean-in-place (0,1 M NaOH, voda, fosfátový pufr) obnovila plnou kapacitu i selektivitu po více než 1000 injekcích bez ztráty retence, výtěžnosti, šířky píku či tailingu.

Přínosy a praktické využití metody

• Řízené a rychlé stanovení titru mAb v buněčných supernatantech
  
• Vysoká selektivita pro relevantní podtřídy IgG (včetně IgG3)
  
• Široký lineární rozsah a vysoká naložní kapacita
  
• Možnost práce při vysokých průtocích s nízkou zátěží tlaku
  
• Kompatibilita s různými elucečními pufry a jednoduchá regenerace
  
• Dlouhá životnost kolony, robustní výkon i při stovkách až tisících injekcí

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může směřovat k rozšíření monolitických podpor pro jiné biomolekuly (např. Fc-fusion proteiny), automatizaci procesu stanovení titru v online režimu, integraci s LIMS, a návrhu vícecestných separačních schémat kombinuje Protein A i Protein G pro komplexní profilaci mAb směsí. Možnost vyšších průtoků a modulární formát monolitů slibuje zvýšení propustnosti a efektivity v high-throughput prostředích.

Závěr

Agilent Bio-Monolith Protein G kolona představuje univerzální, rychlé a citlivé řešení pro stanovení titru monoklonálních protilátek. Díky vysoké selektivitě, širokému lineárnímu rozsahu, nízkému provoznímu tlaku a robustní regeneraci je vhodná pro rutinní i výzkumné aplikace v biologickém vývoji a výrobě.

Reference

1. Richman D. D.; Cleveland P. H.; Oxman M. N.; Johnson K. M. The binding of Staphylococci protein A by the sera of different animal species. J. Immunol. 1982, 128, 2300–2305.
2. Frank M. B. Antibody Binding to Protein A and Protein G beads. In Molecular Biology Protocols; Frank, M. B., Ed.; Oklahoma Medical Research Foundation: Oklahoma City, USA, 1997.
3. CelLytic B Plus Kit. Technical Bulletin; Sigma-Aldrich Corp., CB0500, CB0050.