Analysis of Monoclonal Antibody N-Glycans by Fluorescence Detection and Robust Mass Selective Detection Using the Agilent LC/MSD XT

Význam tématu

Glykosylace monoclonálních protilátek patří k klíčovým kritériím kvality v biologické léčbě. Přesná identifikace a kvantifikace N-glykanů je nezbytná pro vývoj, validaci výrobního procesu a kontrolu jakosti. Tradiční HILIC-FLD workflow s enzymatickým uvolněním a fluorescenčním značením přináší dobrou kvantifikaci, ale někdy selhává v jednoznačném přiřazení koelujících špiček nebo neočekávaných struktur.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři představují vysoce robustní, rutinně použitelné řešení, které spojuje separaci na HILIC-FLD s růstem spolehlivosti identifikace pomocí online hyphenace k routině vhodnému single quadrupole detektoru Agilent LC/MSD XT. Cílem bylo zachovat nízké provozní tlaky (<600 bar), zkrátit dobu přípravy vzorku pomocí štítku InstantPC a zároveň dosáhnout citlivosti umožňující detekci minoritních glykanů bez dodatečné koncentrace vzorku.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky mAb (CHO mAb 1, Sigma SiLu, NIST mAb RM 8671) byly připraveny automatizovaně na platformě AssayMAP Bravo s Agilent GlykoPrep-plus Rapid N-Glycan Sample Preparation a štítkem InstantPC. Separace probíhala na sloupcích AdvanceBio Glycan Mapping (formáty 2,1×100 mm 1,8 µm – metoda A; 2,1×150 mm 2,7 µm – metoda B; 2,1×150 mm 1,8 µm – metoda C) pomocí Agilent 1260 Infinity II Binary Pump, Multisampler a FLD detektoru (λEx 285 nm, λEm 345 nm). MS část provozovali na Agilent Jet Stream zdroji a single quadrupole Agilent LC/MSD XT s nastavením 500-1 400 m/z, fragmentorem 100 V, VCap 2 500 V.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovali tři gradientní metody cílené na rychlou odezvu a vysoké rozlišení neutrálních a kyselých glykanů při nízkém tlaku. Metoda C poskytla nejlepší rozlišení pro všechny tři mAb profily s dobami běhu 18–37 min. Díky kombinaci high-temperature Jet Stream ionizace a InstantPC značení bylo možné detekovat ionty glykanů včetně minoritních forem podílících se na profilu jen 0,1 % s vysokým S/N. MS data odhalila koeluce špiček, umožnila dekonvoluci a podpořila přesné přiřazení 32 glykanových složek typických pro terapeutické mAb.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby přípravy díky InstantPC značení (do 1 h manuálně, paralelně na Bravo).
• Online kombinace FLD kvantifikace s MS identifikací v jednom běhu.
• Bez nutnosti dodatečné koncentrace či sušení vzorku.
• Kompatibilita s většinou LC systémů při provozu do 600 bar.
• Detekce minoritních glykanů a jednoznačné přiřazení i koelujících doplňkových struktur.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření na komplexnější glykoformy a další posttranslační modifikace. Automatizace přípravy s vyšším stupněm paralelismu umožní rostoucí throughput. Integrace s pokročilými algoritmy a umělou inteligencí podpoří rychlejší interpretaci MS dat. Dále lze optimalizovat nové ionizační štítky pro ještě vyšší citlivost a selektivitu.

Závěr

Popsaná metoda spojuje robustní fluorescence-based kvantifikaci s jednoznačnou strukturální identifikací pomocí single quadrupole MS. Workflow nabízí rychlé, citlivé a spolehlivé řešení pro monitoring N-glykanů u terapeutických mAb bez ztráty dat či výkonu a s minimálními požadavky na vzorky.

Reference

• Application Note 5991-4886EN – AdvanceBio Glycan Mapping column.
• Application Note 5991-6958EN – online hyphenace HILIC-FLD k Q-TOF.
• Application Note 5991-5253EN – struktura glykanů pomocí MS/MS.
• Agilent Technologies, Inc. Application Note 5991-8071EN (2020).