High-Throughput Fluorescence-Based mAbs Aggregation Analysis Workflow

Význam tématu

Monoklonální protilátky se uplatňují v široké škále biologických léčiv. Agregace mAb ovlivňuje jejich stabilitu, imunogenicitu a kvalitu finálního produktu, proto je rychlé a spolehlivé hodnocení tendence k agregaci klíčové v moderním vývoji a výrobě farmaceutik.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit vysoce výkonný vysokoprůchodový workflow založený na fluorescenční analýze s použitím PEPBOPS barviva v komplementu k tradiční chromatografii vyměňováním velikosti (SEC). Hlavními úkoly bylo zkrátit dobu analýzy, vyhodnotit korelaci s SEC a posoudit vliv fluorescenčního barviva na agregaci.

Použitá metodika

Pro připravu vzorků byla prováděna nucená agregace mAb (Rituximab, Trastuzumab, NISTmAb RM 8671) pomocí:

• pH stressu: dočasné zakyselení vzorků na pH 2,4–2,6 a inkubace při 37 °C pro vznik převážně rozpustných agregátů;
• shake stressu: mechanická turbulence při 1200 RPM s následným oddělením nerozpuštěných částic centrifugací.

Agregace byla vyhodnocena SEC na Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert LC, následně byly vzorky smíchány s fluorescenčními barvivy (PEPBOPS, Bis-ANS, SYPRO Orange) a analyzovány na Agilent Cary Eclipse Microplate Reader.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert LC systém s AdvanceBio SEC 4.6×300 mm kolonkou;
• Agilent Cary Eclipse Microplate Reader s 96-well destičkou;
• Vivaspin 500 (MWCO 10 kDa) pro výměnu pufru;
• Benchtop vortex mixer pro shake stress.

Hlavní výsledky a diskuse

Transientní pH stress zvýšil podíl HMW agregátů až z 1,2 % na více než 6 % u Rituximabu. Meření fluorescence ukázalo: silnou lineární korelaci signálu PEPBOPS při 475 nm s podílem HMW agregátů (R2 ≥ 0,95) pro všechny tři mAb v rozsahu ~1 % až ≥ 16 %. PEPBOPS vykazoval podstatně nižší pozadí než Bis-ANS a SYPRO Orange a tedy vyšší citlivost. Přesnost odhadu agregace byla ± 0,6–0,8 %. Workflow fungoval spolehlivě i pro biosimilární Rituximab a PEPBOPS neovlivnil samotný proces agregace.

Přínosy a praktické využití metody

• Analýza trvá ~5 s na vzorek namísto ~5 min u SEC, což umožňuje rychlý předvýběr;
• Workflow může sloužit jako front-end pro detailní SEC analýzu, čímž se zaměří analytické zdroje na klíčové vzorky;
• Vhodné pro screening stovek až tisíců mAb variant v raných fázích vývoje, QA/QC i formulaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace vysokoprůchodových fluorescenčních metod s automatizovanými platformami umožní další zrychlení a miniaturizaci screeningových workflow. Kombinace s pokročilou datovou analýzou a AI přinese přesnější predikci struktury a stability mAb. Rozšíření na jiné proteinové biologiky a multiplexní assay rozšíří možnosti charakterizace v biotechnologickém vývoji.

Závěr

Použití Agilent Cary Eclipse Microplate Reader s PEPBOPS barvivem představuje efektivní, citlivou a rychlou metodu pro semi-kvantitativní odhad agregace mAb. Workflow doplňuje a urychluje tradiční SEC analýzu, čímž přináší významné časové úspory a zvyšuje produktivitu při vývoji biologických léčiv.

Reference

1. Eon-Duval A., Broly H., Gleixner R. Quality attributes of recombinant therapeutic proteins: an assessment of impact on safety and efficacy as part of a quality by design development approach. Biotechnol Prog. 2012;28:608–622.
2. High-Resolution, High-Throughput Size Exclusion Chromatography Analysis of Monoclonal Antibodies. Agilent publication 5994-0828EN.
3. Saro D., et al. Developability assessment of a proposed NIST monoclonal antibody. In: State-of-the-Art and Emerging Technologies for Therapeutic Monoclonal Antibody Characterization Volume 2. ACS Publications; 2015. p. 329–355.
4. Lee KH., et al. Analytical similarity assessment of rituximab biosimilar CT-P10 to reference medicinal product. MAbs. 2018;10:380–396.
5. López-Morales CA., et al. Physicochemical and Biological Characterization of a Biosimilar Trastuzumab. Biomed Res Int. 2015.
6. Eppler A., Weigandt M., Hanefeld A., Bunjes H. Relevant shaking stress conditions for antibody preformulation development. Eur J Pharm Biopharm. 2010;74:139–147.
7. Li Y., Mach H., Blue JT. High throughput formulation screening for global aggregation behaviors of three monoclonal antibodies. J Pharm Sci. 2011;100:2120–2135.
8. He F., et al. Detection of IgG aggregation by a high throughput method based on extrinsic fluorescence. J Pharm Sci. 2010;99:2598–2608.
9. Hawe A., Sutter M., Jiskoot W. Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization. Pharm Res. 2008;25:1487–1499.
10. A Comparative Study of the Intact Mass, Subunit Mass and Released Glycans of Two Rituximab Biosimilars Using High Resolution LC-MS. Agilent publication 5994-1653EN.