Separate and Quantify Rituximab Aggregates and Fragments with High-Resolution SEC

Význam tématu

Velmi účinné sledování agregace a fragmentace monoklonálních protilátek je klíčové pro zajištění jejich bezpečnosti a účinnosti. Metoda size exclusion chromatography (SEC) umožňuje za nativních podmínek rychlou a spolehlivou separaci monomerů, vysokomolekulárních a nízkomolekulárních variant. U rituximabu a jeho biosimilars je kontrola těchto variant zásadní pro validaci kvality a srovnatelnosti.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této práce je demonstrovat vysoké rozlišení a kvantifikaci intact, agregátů a fragmentů inovátorského i biosimilárního rituximabu po nucených degradacích. Studie využívá Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC systém spolu s kolonou AdvanceBio SEC 300Å (2.7 µm).

Použitá metodika a instrumentace

• LC systém: Agilent 1260 Infinity Quaternary Bio-inert.
• Kolona: Agilent AdvanceBio SEC 300Å, 7.8×300 mm, 2.7 µm.
• Mobilní fáze: PBS (50 mM fosfát, 150 mM NaCl, pH 7.4).
• Detekce: UV při 220 a 280 nm.
• Kalibrace: standardní proteiny (vitamín B12, myoglobin, ovalbumin, g-globulin, thyroglobulin).
• Příprava stresovaných vzorků: pH skoky a inkubace při 60 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

• Kolona vykázala lineární kalibrační křivku pro molekulové hmotnosti 1.35–670 kDa s R²=0.9969.
• Intaktní formy rituximabu (inovátor a biosimilární) se elukovaly při čas kolem 8.28 min, s RSD retenčního času menším než 0.04 % a RSD plochy nižším než 1 %.
• Po stresu se značně zvýšila relativní množství agregátů a fragmentů, přičemž monomer klesl na 13–17 %.
• Kolona umožnila jasné rozlišení různých mAb a ADC (cetuximab, trastuzumab, ADC, rituximab) na základě retenčního času.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysoké rozlišení i citlivost pro rutinní kontrolu kvality mAb ve farmaceutickém vývoji a výrobě. Umožňuje spolehlivou kvantifikaci agregace a degradace bez potřeby složitých modifikací analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na nové biologické formy včetně konjugovaných protilátek a multimerních forem.
• Integrace s vícedimenzionálními technikami pro podrobnější charakterizaci.
• Automatizace a online senzory pro monitoring stability během výrobního procesu.

Závěr

Použití Agilent AdvanceBio SEC 300Å s Bio-inert LC systémem poskytuje jednoduchou, reprodukovatelnou a vysoce rozlišující metodu pro analýzu intact a stresovaných vzorků rituximabu. Výsledky potvrzují vhodnost této kolony a LC platformy pro robustní kontrolu kvality biologických léčiv.

Reference

• Başak Kükrer B, Filipe V, van Duijn E, Kasper PT, Vreeken RJ, Heck AJR, Jiskoot W. Mass Spectrometric Analysis of Intact Human Monoclonal Antibody Aggregates Fractionated by Size-Exclusion Chromatography. Pharm Res 2010;27:2197-2204.
• Rodriquez-Diaz R, Wehr T. Use of Size Exclusion Chromatography in Biopharmaceutical Development. In: Analytical Techniques for Biopharmaceutical Development; CRC Press; 2005.