See it all with Uncle's full-spectrum analysis

Význam tématu

Měření termální stability proteinů je zásadní pro optimalizaci formulací biologických léčiv a pochopení jejich chování při teplotních změnách. Kombinace měření fluorescenční denaturace a světelných rozptylů poskytuje komplexní obraz stability molekul, což usnadňuje vývoj stabilních a účinných proteinových produktů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je představit platformu Uncle, která umožňuje simultánní měření termální stability proteinů pomocí třech metod fullspectrum fluorescence, statického a dynamického světelného rozptylu. Studie demonstruje použití bezbarvné i barvivy značené analýzy na příkladech různých proteinů a podmínek.

Použitá metodika a instrumentace

• Platforma Uncle s detekcí fullspectrum fluorescence, statického (SLS) a dynamického (DLS) světelného rozptylu
• Teplotní rampy od 25 do 95 °C při rychlosti 0,6 °C za minutu
• Vícežilkové křemenné kyvety pro vzorky o objemu 9 µl
• Možnost paralelního měření až 48 vzorků
• Lasery pro excitaci na vlnových délkách 266, 473 a 660 nanometrů
• Softwarová analýza barycentrického průměru (BCM) a AUC pro stanovení teplot tání (Tm) a agregace (Tagg)

Hlavní výsledky a diskuse

• U monoklonálního IgG se bezbarvná a SYPRO Orange značená analýza shodně určily Tm kolem 70 °C, což potvrzuje, že barvivo neovlivňuje termodynamický stav denaturace
• SLS prokázal, že SYPRO Orange zpomaluje tvorbu malých agregátů pravděpodobně blokací hydrofobních zbytků
• U RNázy A bez tryptofanu umožnilo barvivo ANS sledovat denaturaci a zvýšení koncentrace fosfátového pufru vedlo ke stabilizaci proteinu, což se projevilo vyššími hodnotami Tm
• U BLG platforma porovnala intrinsickou fluorescenci a CPM značení, kdy CPM reagujícím s volnou cysteinu poskytlo doplňující informace o stavu proteinu při 45 a 65 °C

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost simultánního sledování struktury a agregace v jednom experimentu
• Vysoká citlivost u modelů s nízkou intrinsickou fluorescencí díky extrinsickým barvivům
• Úspora vzorků díky malému objemu a možnost paralelního měření
• Široké aplikace od screeningových studií až po detailní biochemickou charakterizaci biologik

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace dalších fluorescenčních sond pro zkoumání interakcí a vazebních vlastností proteinů
• Automatizace a zvyšování propustnosti pro rozsáhlé screeningové kampaně
• Využití v kombinaci s dalšími biofyzikálními metodami pro holistický pohled na stabilitu bílkovin
• Rozšíření použití na hybridní nanomateriály a komplexní lékově nosné systémy

Závěr

Platforma Uncle poskytuje komplexní a flexibilní přístup k analýze termální stability proteinů. Kombinovaná detekce fullspectrum fluorescence a světelných rozptylů spolu s pokročilou softwarovou analýzou umožňuje přesné stanovení tání i tvorby agregátů. Metoda nachází uplatnění v biotechnologickém výzkumu, farmaceutickém vývoji i kvalitativní kontrole proteinových produktů.

Reference

1. Jarasch A et al Developability assessment during the selection of novel therapeutic antibodies Journal of Pharmaceutical Sciences 2015 104 6 1885–1898
2. He F et al Detection of IgG aggregation by a high throughput method based on extrinsic fluorescence Journal of Pharmaceutical Sciences 2010 99 6 2598–2608
3. Semisotnov GV et al Study of the molten globule intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent probe Biopolymers 1991 31 1 119–128
4. Sigma Aldrich Product Description for 8 Anilino 1 naphthalenesulfonic acid ammonium salt
5. Stelea S et al Thermal unfolding of ribonuclease A in phosphate at neutral pH deviations from the two state model Protein Science 2002 10 5 970–978
6. Alexandrov A et al Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins Structure 2008 16 3 351–359