Uncle stays hot for proteins with isothermal apps

Význam tématu

Předčasné stanovení termální stability proteinů umožňuje rychlou identifikaci vhodných kandidátů pro dlouhodobé skladování a formulaci biologických léčiv. Instrument jako Uncle kombinující plnospektrální fluorescenci, statické a dynamické rozptylové techniky v malých objemech přináší vysokou propustnost a detailní obraz stability proteinů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat využití čtyř aplikací Uncle pro hodnocení stability monoklonální protilátky mAb1 a enzymu RNáza A v různých solných formulacích. Studie zahrnovala metody termálního rampování, využití extrinzického barviva SYPRO Orange, izotermální testy a dlouhodobou stabilitu pomocí DLS.

Použitá instrumentace

• Zařízení Uncle od Unchained Labs
• Detekce: plnospektrální fluorescenční skenování (250–720 nm), statický rozptyl (SLS) a dynamický rozptyl (DLS)
• Lasery: excitace při 266 nm pro vnitřní fluorescenci, 473 nm pro SYPRO Orange a SLS
• Kvartové kyvety o objemu 9 μl, těsněné silikonovými zátkami
• Ovládání teploty: 15–95 °C a možnost izotermického držení

Použitá metodika

• Snížení koncentrace mAb1 z 26 na 1 mg/ml v 25 mM His-HCl pH 7,4 s 0, 50 nebo 250 mM NaCl
• Příprava RNázy A na 1 mg/ml ve stejných formulacích po rekonstituci z lyofilizátu
• Termální rampy 15–95 °C při 1 °C/min, sledování Tm a Tagg aplikacemi Tm & Tagg a Tm using SYPRO
• Izotermické měření při 60 °C po dobu 16 h s kontinuálním sběrem fluorescenčních a SLS dat
• Dlouhodobá stabilita: inkubace vzorků při 60 °C mimo zařízení a denní měření velikosti částic DLS v Uncle

Hlavní výsledky a diskuse

Termální rámcové experimenty odhalily Tm monoklonální protilátky kolem 70 °C a nejvyšší odolnost proti agregaci v bezsolné formulaci. Tagg podporovala přednostní agregaci při 50 mM NaCl. SYPRO Orange odhalilo dva tepelné přechody, kdy druhý odpovídá tvorbě agregátů. Izotermické testy ukázaly, že agregace v 50 mM NaCl začíná rychleji než v ostatních podmínkách.
U RNázy A byl Tm kolem 61 °C ve všech formulacích, přičemž vnitřní fluorescenční metoda nebyla použitelná. Izotermické a dlouhodobé DLS testy potvrdily, že nejstabilnější je enzym v 250 mM NaCl, zatímco v 0 a 50 mM NaCl docházelo k agregaci po přibližně 10 h až 2 dnech.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysokopropustné screeny stability s minimálními objemy vzorku
• Současné sledování termálního denaturování (Tm) a agregace (Tagg)
• Předčasná selekce formulací pro dlouhodobé studie
• Flexibilita izotermických i multi-denních experimentů

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat integraci s automatizovanými platformami a umělou inteligencí pro návrh optimálních formulací, rozšíření detekčních režimů pro různé biomolekuly a zkrácení doby analýzy díky optimalizovaným protokolům.

Závěr

Uncle představuje komplexní a efektivní řešení pro hodnocení stability proteinů v rané fázi vývoje biologických léčiv. Kombinace termálních ramp, izotermických měření a dlouhodobých DLS testů umožňuje rychlou a spolehlivou identifikaci nejvhodnějších formulací, což šetří čas i vzácný materiál.