From Nanoflow to Standard Flow LC/MS for Routine Quantitative Plasma Proteomics in Diabetic Kidney Disease Research

Význam tématu

Analytické sledování proteinových biomarkerů v lidské plazmě hraje klíčovou roli včasné detekce a prognózy diabetické renální nemoci (DKD). Současné klinické testy (ACR, eGFR) nedokáží spolehlivě identifikovat časné stadium onemocnění. MS-bazované proteomické metody umožňují kvantitativní měření nízce exprimovaných proteinů, což přispívá k rozvoji přesnějších diagnostických testů.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřuje na přenos nanoflow LC/MS workflow (PromarkerD) na robustnější a rutinně využitelnou standard flow platformu Agilent 1290 Infinity II LC spojenou s Agilent 6495 triple kvadrupólem. Cílem bylo porovnat kvalitu dat, reprodukovatelnost a analytickou citlivost mezi oběma konfiguracemi při analýze osmi peptidů čtyř proteinů v plazmě z diabetické kohorty (FDS).

Použitá metodika a instrumentace

Analytické vzorky vznikly z EDTA plazmy 12 subjektů po předchozí depleci nejhojnějších proteinů i bez ní. Metoda dynamic MRM cílila 21 endogenních a 17 izotopově značených peptidů. Chromatografická separace probíhala na koloně ZORBAX Eclipse Plus Rapid Resolution C18 (50 × 2,1 mm, 1,8 µm) s gradientem 2–26 minut při průtoku 0,4 mL/min. MS parametry zahrnovaly AJS ESI pozitivní režim, teplotu 150 °C, průtok sušícího plynu 15 L/min, kapilární napětí 4 kV.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání 12 plazmatických vzorků na nanoflow a standard flow platformě prokázalo srovnatelnou kvantifikaci osmi peptidů čtyř proteinů (APOA4, CD5L, FHR2, IBP3) s odchylkami pod 20 %. Dot-product skóre mezi MRM chromatogramy a referenčními MS/MS spektry potvrdilo vysokou selektivitu a kvalitu dat. Analýza v neodstraněné plazmě na standard flow systému dosáhla reprodukovatelnosti RSD < 20 % i bez předchozí deplece proteinů. Také v odebrané plazmě zůstala citlivost a robustnost metody vysoká při minimální přípravě vzorků.

Přínosy a praktické využití metody

• Standard flow LC/TQ kombinuje vysokou reprodukovatelnost a jednoduchou obsluhu vhodnou pro rutinní laboratorní provoz.
• Možnost kvantifikace biomarkerů v celé plazmě eliminuje nutnost časově náročné deplece nejhojnějších proteinů.
• Metoda poskytuje spolehlivá data pro klinickou prognózu diabetické renální nemoci.
• Kompatibilita se softwarem Skyline usnadňuje zpracování a validaci výsledků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další validace metody na rozsáhlejších kohortách pacientů a různých typech vzorků.
• Integrace s automatizovanými platformami pro zvýšení throughputu a snížení chybovosti.
• Rozšíření cíleného MRM panelu o nové kandidátní proteiny spojené s jinými onemocněními.
• Implementace do klinických zkoušek a laboratorních standardů jako diagnostický a prognostický nástroj.

Závěr

Transfer proteomického workflow PromarkerD z nanoflow na standard flow LC/TQ prokázal ekvivalentní analytickou citlivost a vynikající reprodukovatelnost. Metoda umožňuje rutinní kvantitativní analýzu klíčových biomarkerů diabetické renální nemoci v celé plazmě bez potřeby náročné přípravy vzorků. Výsledky podporují možnosti dalšího rozvoje klinických průkazných studií a implementace do laboratorní praxe.

Reference

• Dunkler D. et al. Risk Prediction for Early CKD in Type 2 Diabetes. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 2015;10(8):1371–1379.
• Peters K. E. et al. Identification of novel circulating biomarkers predicting rapid decline in renal function in type 2 diabetes: the Fremantle diabetes study phase II. Diabetes Care. 2017;40(11):1548–1555.
• Peters K. E. et al. Validation of a Protein Biomarker Test for Predicting Renal Decline in Type 2 Diabetes: The Fremantle Diabetes Study Phase II. J. Diabetes Complications. 2019;27:107406.
• Bringans S. D. et al. Comprehensive Mass Spectrometry Based Biomarker Discovery and Validation Platform as Applied to Diabetic Kidney Disease. EuPA Open Proteomics. 2017;14:1–10.
• Percy A. J. et al. Comparison of Standard- and Nano-Flow Liquid Chromatography Platforms for MRM-Based Quantitation of Putative Plasma Biomarker Proteins. Anal. Bioanal. Chem. 2012;404(4):1089–1101.
• Davis T. M.; Bruce D. G.; Davis W. A. Cohort Profile: The Fremantle Diabetes Study. Int. J. Epidemiol. 2013;42(2):412–421.