Case Study of Inter-lab Cross platform Transfer of a Protein Biomarker Quantitation Assay for Routine Analysis in Clinical Research

Význam tématu

Diabetická nefropatie je hlavní příčinou selhání ledvin a její časné predikce pomocí stávajících klinických testů je omezena. Identifikace nových proteinových biomarkerů a vyvinutí spolehlivých testů pro včasné odhalení poškození ledvin u diabetiků je klíčová pro zlepšení prevence a léčby.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat mezijiné a meziploatformní přenesení MRM-bazované kvantitativní analýzy proteinových biomarkerů PromarkerD z nanoflow LC/MS platformy na standardní tok LC/TQ systém. Test PromarkerD zahrnuje čtyři proteiny, jejichž kvantifikace může pomoci předpovědět rychlý pokles renální funkce u pacientů s diabetem 2. typu.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza probíhala metodou dynamického MRM na standardním tokovém systému Agilent 1290 Infinity II LC propojeném s triple kvadrupólem Agilent 6495 LC/TQ a AJS iontovým zdrojem. Pro separaci byl použit ZORBAX Eclipse Plus Rapid Resolution C18 sloupec 50 × 2,1 mm, 1,8 µm. Syntetický mix peptidů reprezentujících cílové biomarkery byl přidán do referenčního séra a vzorky krevní plazmy (celé i imunodepletované). Parametry MS zahrnovaly teplotu plazmového plynu 150 °C, průtok sušicího plynu 15 L/min, pozitivní ESI režim a cyklus 500 ms.

Hlavní výsledky a diskuse

Meziplatformní porovnání ukázalo vysokou shodu kvantitativních dat pro osm sledovaných peptidů z čtyř proteinů mezi nanoflow a standardním tokem. MRM chromatogramy peptidu LEPYADQLR z apolipoproteinu A-IV prokázaly symetrické a intenzivní píky s vysokými dotp hodnotami, což potvrzuje kvalitní kvantifikaci. Detekce biomarkerů v celé plazmě bez deplece top 14 proteinů potvrzuje dostatečnou analytickou citlivost systému 6495 LC/TQ.

Přínosy a praktické využití metody

• Standardní tokový LC/TQ systém nabízí vhodnou platformu pro rutinní analýzy s dostatečnou citlivostí pro detekci PromarkerD proteinů v neodstředěné plazmě.
• Přenos metody mezi laboratořemi a platformami byl úspěšný, což podporuje standardizaci a rozšíření testu do klinických laboratoří.
• Automatizovaný MRM přístup zajišťuje vysokou opakovatelnost a robustnost pro QA/QC v klinickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může zahrnovat rozšíření panelu biomarkerů pro komplexnější hodnocení renální funkce, integraci do vysokopropustných robotizovaných pracovních postupů a validaci ve větších kohortách pacientů. S rostoucími požadavky na personalizovanou medicínu se očekává kombinace proteomických dat s genomickými a metabolomickými profily.

Závěr

Studie prokázala, že přenos MRM-bazované metody PromarkerD z nanoflow na standardní tokový LC/TQ systém je možný bez ztráty analytické kvality. Standardní tokový přístup usnadňuje rutinní analýzu biomarkerů a otevírá cestu k implementaci v klinických laboratořích pro včasnou diagnostiku diabetické nefropatie.

Reference

• Peters KE et al. Identification of novel circulating biomarkers predicting rapid decline in renal function in type 2 diabetes: the Fremantle diabetes study phase II. Diabetes Care 2017
• Peters KE et al. Validation of a Protein Biomarker Test for Predicting Renal Decline in Type 2 Diabetes: The Fremantle Diabetes Study Phase II. J. Diabetes Complications 2019
• Coleman O et al. From Nanoflow to Standard Flow LC/MS for Routine Quantitative Plasma Proteomics in Diabetic Kidney Disease Research. Agilent application note 5994-2381EN 2020