Quantification of Frataxin-M Protein, a Blood Biomarker of the Rare Disease Friedreich’s Ataxia

Význam tématu

Frataxin-M je mitochondriální protein klíčový pro transport železa a ochranu buněk před oxidačním stresem. Jeho snížená hladina v krvi je hlavním biomarkerem Friedreichovy ataxie (FRDA), vzácné dědičné neurodegenerativní choroby charakterizované progresivní ataxií a kardiomyopatií. Přesná a spolehlivá kvantifikace frataxin-M v krevních buňkách je nezbytná jak pro diagnostiku a sledování průběhu onemocnění, tak pro hodnocení účinnosti nových terapií.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat kvantitativní výkon standard-flow LC/TQ systému Agilent 6495 se stávajícím trap-and-elute nanoflow LC/MS systémem v režimu PRM pro analýzu frataxin-M v lidské krvi. Do studie bylo zařazeno 2 zdravé kontroly a 38 homozygotních FRDA pacientů. Vzorky krve byly zpracovány přímým přidáním stabilně označeného frataxin-M (SILAC) jako interního standardu, obohaceny imunoprecipitací a enzymovou štěpnou s proteázou Asp-N, následováno LC/MS analýzou na obou platformách.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky celé krve byly nejprve lyzovány NP-40 pufrem a sonikací. Do každého vzorku byl přidán interní standard (20 ng SILAC-frataxin-M) před imunoprecipitací, která probíhala s DMP kovalentně vázaným anti-frataxin monoclonálním protilátkám na protein G magnetických kuličkách. Po elučním kroku následovala noční digesce Asp-N enzymem.

Seznam hlavní instrumentace:

• Agilent 6495 triple quadrupole LC/MS v MRM režimu spojený s Agilent 1290 Infinity II standard-flow UHPLC
• Trap-and-elute nanoflow UHPLC spojený s orbitálním vysokým rozlišením MS v PRM režimu
• Protein G magnetické kuličky, DMP crosslinking, proteáza Asp-N

Hlavní výsledky a diskuse

Standard-flow LC/TQ metoda dosáhla pro peptidy SGTLGHPGSL a DLSSLAYSGK lineární odezvy R2 ≥ 0,998, nižší limity detekce (LOD ~0,08 ng) a kvantifikace (LOQ ~0,23 ng) při objemu vstřiku 2 µL. Nanoflow PRM metoda ukázala méně příznivé parametry (R2 0,96–0,995, LOD 0,17–0,45 ng, LOQ 0,54–1,44 ng) při objemu vstřiku 8 µL. Doba jedné analýzy na Agilent 6495 byla 11 minut versus 105 minut na nanoflow UHPLC-PRM, což při zpracování 40 vzorků znamená zkrácení doby z více než osmi dnů na méně než jeden den.

Přínosy a praktické využití metody

- Výrazně vyšší propustnost a robustnost měření pro klinické studie s velkým počtem pacientů
- Nižší nároky na údržbu přístrojového vybavení oproti nanoflow systému
- Vyšší citlivost a reprodukovatelnost výsledků s menším objemem vzorku

Budoucí trendy a možnosti využití

- Rozšíření standard-flow LC/TQ aplikací na další nízko abundantní proteiny a biomarkery
- Automatizace vzorkovací přípravy a integrace do klinických workflow
- Multiplexní kvantifikace souboru proteinových biomarkerů v jedné analýze

Závěr

Standard-flow UHPLC-MRM/MS metoda na platformě Agilent 6495 přináší významná zlepšení v citlivosti, přesnosti, čase analýzy a provozní stabilitě oproti trap-and-elute nanoflow PRM systému. Tato technologie je vhodnější pro vysokopropustné kvantifikace frataxin-M v celé krvi při výzkumu a klinickém sledování Friedreichovy ataxie.

Reference

• Evans-Galea M. V. et al. Cell and Gene Therapy for Friedreich Ataxia: Progress to Date. Hum. Gene Ther. 2014;25(8):684–93.
• Pousset F. et al. A 22-Year Follow-up Study of Cardiac Outcome in Friedreich Ataxia. JAMA Neurol. 2015;72(11):1334–41.
• Lynch D. R. et al. Safety and Potential Benefit of Omaveloxolone in Friedreich Ataxia. Ann. Clin. Transl. Neurol. 2019;6(1):15–26.
• Santos R. et al. Friedreich Ataxia: Molecular Mechanisms and Therapeutic Opportunities. Antioxid. Redox Signal. 2010;13(5):651–90.
• Gellera C. et al. Frataxin Gene Point Mutations in Italian Friedreich Ataxia Patients. Neurogenetics 2007;8(4):289–99.
• Sacca F. et al. Analysis in Friedreich Ataxia: Implications for Diagnosis and Trial Design. PLoS One 2011;6(3):e17627.
• Rotig A. et al. Aconitase and Mitochondrial Iron-Sulphur Protein Deficiency in Friedreich Ataxia. Nat. Genet. 1997;17(2):215–7.
• Delatycki M. B.; Bidichandani S. I. Friedreich Ataxia – Pathogenesis And Therapeutic Implications. Neurobiol Dis. 2019;132:104606.
• Doni D. et al. Displacement of Frataxin Correlates with Bioenergetic Defects. FASEB J. 2021;35(3):e21362.
• Monfort B. et al. Advances in Frataxin Biochemical Function. Front Neurosci. 2022;16:838335.
• Guo L. et al. New Extra-Mitochondrial Isoform of Frataxin in Erythrocytes. Sci. Rep. 2018;8(1):17043.
• Rodden L. N. et al. DNA Methylation in Friedreich Ataxia Silences Frataxin Isoform E. Sci. Rep. 2022;12(1):5031.
• Wang Q. et al. Simultaneous Quantification of Mitochondrial and Extra-Mitochondrial Frataxin. Front. Neurosci. 2022;16:874768.
• Blair I. A. et al. Current State of Biomarker Research for Friedreich’s Ataxia. Future Sci. OA. 2019;5(6):FSO398.
• Guo L. et al. LC-HRMS Analysis of Platelet Frataxin as Biomarker. Anal. Chem. 2018;90(3):2216–23.