Application of High- and Low-resolution Mass Spectrometers Combined with Nanoscale LC and Microfluidic LC Platforms for the Quantitative Analysis of Peptide Biomarkers in Human Serum

Význam tématu

Validní a citlivá kvantifikace peptidových biomarkerů v lidském séru je klíčová pro translaci proteomických objevů do klinické praxe. Metody založené na cílené LC-MS/MS analýze umožňují detekci při velmi nízkých hladinách, široký dynamický rozsah a vysokou selektivitu potřebnou pro ověření potenciálních biomarkerů v rozsáhlých souborech vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat osm různých konfigurací LC-MS systémů složených z nano- a mikrofluidní kapalinové chromatografie se čtyřmi masovými spektrometry (tandemové kvadrupoly a oa-ToF) pro kvantitativní MRM analýzu tryptických peptidů ve nevýběrovém, nedepleovaném lidském séru. Hodnoceny byly parametry průtoková rychlost, citlivost, linearita a reprodukovatelnost.

Použitá instrumentace

• Kapalinová chromatografie nanoscale: ACQUITY UPLC M-Class se symetrickou C18 pastou (trap) a HSS T3 kolonkou
• Kapalinová chromatografie mikrofluidika: ionKey Peptide BEH C18 (iKey) s microflow pumpou
• Masové spektrometry: Xevo TQ-S, Xevo TQ-S micro (tandemové kvadrupoly), Xevo G2-XS QTof, SYNAPT G2-Si (oa-ToF)

Použitá metodika

Do trypticky štěpeného, nedefrakcionovaného séra byly připraveny 15 peptidů značených stabilními isotopy (SIL) v koncentracích od 6,25 amol do 12,5 fmol na µl. Šarže obnášela redukci, alkylaci, digesci RapiGestem a trypsinem, následné odstranění detergentu a centrifugaci. Pro nanoLC byly použity gradienty 3–40 % B v 90 minutách při 300 nl/min, pro mikrofluidiku 3–40 % B v 45 minutách při 1 µl/min.
MRM a ToF-MRM analýzy cílovaly tři přechody na peptid se stanoveným nastavením kolizních energií, optimalizovaných pro každý přístroj.

Hlavní výsledky a diskuse

Průtoková rychlost: Mikr​ofluidický režim dosáhl 2× vyšší propustnosti (1 h cyklus) oproti nanoLC (2 h cyklus) bez ztráty selektivity. Citlivost: NanoLC-MS mělo průměrný LLOD 5–8 amol, mikrofluidika 20–39 amol, tedy asi 4× rozdíl ve prospěch nanoLC. Linearita: Všechny konfigurace vykázaly váženou 1/x regresi s r2 ≥ 0,986. Reprodukovatelnost: %RSD koncentračních výsledků pro endogenní peptidy byla ≤ 16 %, nejlepších výsledků dosáhly tandemové kvadrupoly.

Přínosy a praktické využití

• Microflow LC s tandemovým kvadrupolem (Xevo TQ-S) nabízí výhodný kompromis mezi citlivostí, propustností a robustností pro velké koherentní studie.
• NanoLC-MS je ideální pro maximální citlivost, zvláště při detekci stopových biomarkerů.
• Vysoká linearita a selektivita MRM usnadňují validaci kandidátních biomarkerů ve velkých kohortách.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další miniaturizace a integrace mikrofluidních a nanoLC technologií s automatizací přípravy vzorků. Vylepšení vysokorozlišovacích detektorů a strojového učení pro analýzu dat povede k ještě citlivějším a spolehlivějším kvantitativním protokolům v klinické proteomice. Rozvoj multiplexních a multi-omických přístupů pro simultánní sledování většího počtu biomarkerů podpoří personalizovanou medicínu.

Závěr

Porovnání osmi LC-MS konfigurací ukázalo, že mikrofluidní LC v kombinaci s tandemovým kvadrupolem Xevo TQ-S představuje vyvážené řešení pro vysokou průchodnost a dostatečnou citlivost v translational research. Pro maximální citlivost v nižších hladinách je však vhodnější nanoLC-MS přístupy.

Reference

1. Mbasu et al. Advances in Quadrupole and Time-of-Flight Mass Spectrometry for Peptide MRM based Translational Research Analysis. Proteomics, in press, May 23, 2016. doi:10.1002/pmic.201500500