Assessing key attributes of adeno-associated viral proteins using HPLC-FLD-intact mass analysis

Význam tématu

Rekombinantní adeno-asociované viry (rAAV) patří k nejperspektivnějším vektorům genové terapie díky vysoké účinnosti a bezpečnostnímu profilu. Strukturní proteiny VP1, VP2 a VP3 tvoří kapsidu viru a jejich vzájemný poměr i modifikace ovlivňují infektivitu, stabilitu a účinnost vektorů. Pečlivé sledování identity, poměrů jednotlivých VP a posttranslačních modifikací (PTM) je klíčové pro vývoj a průmyslovou výrobu AAV přípravků s garantovanou kvalitou a bezpečností výrobku.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit robustní metodiku kombinující ultra-vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s fluorescenční detekcí (UHPLC-FLD) a vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrii (HRAM MS) na platformě Thermo Scientific Orbitrap Exploris MX. Metoda má umožnit rychlou charakterizaci identity VP1, VP2 a VP3, stanovení jejich relativních poměrů a detekci PTM napříč různými AAV serotypy (AAV1, AAV6, AAV8, AAV9).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky AAV (in-house AAV6, AAV9 a komerčně dostupné AAV1, AAV6, AAV8, AAV9) byly denaturovány, redukovány TCEP a koncentrovány v 80 % H2O/20 % acetonitril s 0,1 % kyseliny mravenčí. Chromatografické rozdělení proběhlo na C4 kolonce (1,0×100 mm, 1,7 μm) s gradientem difluoroctové kyseliny a acetonitrilu, teplota kolony 80 °C, průtok 0,08 mL·min–1. Fluorescenční detekce (λex 280 nm, λem 350 nm) umožnila rychlý kvantitativní odhad poměrů VP. Hmotnostní spektrometrie (ESI, Orbitrap Exploris MX s BioPharma™ rozšířením) byla nastavena na full MS v rozmezí m/z 700–2 800, rozlišení 30 000, přesnost měření < 5 ppm. Data byla dekonvolvována pomocí BioPharma Finder 5.0.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda efektivně rozlišila proteiny VP1, VP2, VP3 i jejich nízkoabundantní proteoformy a fragmenty. Dekonvoluovaná spektra vykázala hmotnostní odchylky menší než 5 ppm pro všechny analyzované formy. Porovnání interně připraveného AAV9 a komerčního AAV9 ukázalo rozdíly v poměrech VP1:VP3 a VP2:VP3, přestože eliční profily byly podobné. U serotypu AAV8 byla identifikována významná fosforylace VP1 a VP2 a acetylace VP3, u AAV6 a AAV1 dominovala pouze acetylovaná forma VP3.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé stanovení poměrů VP1:VP2:VP3 pomocí citlivé FLD detekce.
• Přesné určování intact mass proteoformů s chybou < 5 ppm pro potvrzení serotypu a modifikací.
• Detekce nízkoabundantních PTM a fragmentů pro komplexní charakterizaci výrobních šarží.
• Možnost standardizovaného srovnání kvality mezi různými dávkami a výrobními procesy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metodiky na další AAV serotypy a multiplatformní aplikace, včetně automatizovaného high-throughput screeningu a online QC monitoringu v průběhu výroby. Kombinace s dalšími analytickými technikami (např. kapilární elektroforézou, HDX-MS) může přinést hlubší vhled do strukturálních vlastností kapsidy. Dále je perspektivní integrace dat z hmotové spektrometrie s bioinformatickými nástroji pro predikci stability a imunogenity AAV vektorů.

Závěr

Vyvinutá UHPLC-FLD-HRAM MS metoda na platformě Orbitrap Exploris MX nabízí rychlou, citlivou a vysoce přesnou analýzu klíčových atributů AAV proteomiky. Umožňuje simultánní kvantifikaci poměrů VP, identifikaci PTM a fragmentů, což významně podporuje vývoj a výrobu kvalitních a bezpečných genových vektorů.

Reference

1. Samulski R.J.; Muzyczka N. AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes, Annu. Rev. Virol. 2014, 1(1), 427–451.
2. Naso M.F.; Tomkowicz B.; Perry W.L.; Stroh W.R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy, BioDrugs 2017, 31, 317–334.