On-line Comprehensive RP-LC×RP-LC/IT-TOF for the Analysis of Proteome Isoforms

Význam tématu

Analýza komplexních bílkovinných vzorků je klíčová pro pochopení biologických sítí a detekci nízkoabundantních isoform. Kombinace dvoudimenzionální chromatografie (RP-LC×RP-LC) s hmotnostní spektrometrií (ESI-IT-TOF) nabízí vysoké rozlišení, kapacitu a citlivost.

Cíle a přehled studie

Prezentovaný technický report popisuje on-line propojení dvou fází RP-LC pro separaci peptidů s detekcí PDA a ESI-IT-TOF MS. Modelovým analytem byly tryptické digesáty α-caseinu a jeho dephosphorylované formy.

Použitá instrumentace

• Shimadzu CBM-20A controller
• Shimadzu LC-20AD dual-plunger pumps
• Shimadzu LC-20AB solvent delivery module
• Shimadzu DGU-20A5 degassing unit
• Shimadzu CTO-20A column oven
• Shimadzu SIL-20A autosampler
• Shimadzu SPD-M20A PDA detector
• Shimadzu LCMS-IT-TOF (ESI source)
• 2×100 µL vysokotlaký přepínací ventil
• Software LCMSsolution a ChromSquare

Použitá metodika

• Dimenze 1: RP-LC pH 9 s Ascentis Express Peptide ES-C18 (150×2,1 mm), gradient 0–100 % B ve 220 min, 100 µL/min.
• Dimenze 2: RP-LC pH 2 s Ascentis Express Peptide ES-C18 (30×4,6 mm), modulace 1 min, 4 mL/min.
• Detekce PDA při 215 nm, MS ESI pozitivní mód, m/z 200–2000, akumulace 40 ms.
• Tryptická digesce: α-casein v 0,01 M HCOONH4 (pH 8), var 6 min, štěpení trypsinem 4 h, zastavení TFA.

Hlavní výsledky a diskuse

Kombinovaná separace dosáhla teoretické kapacity až 8540 špiček; praktické hodnoty po zohlednění ortogonality byly 3982 a po korekci podvzorkování 1802.
Reprodukovatelnost retenčních časů byla CV 0,555 %.
Hmotnostní spektrometrie vykazovala chybu 0,5–6 ppm u standardních peptidů.
Sekvenční pokrytí peptidů se zvýšilo na 90,3 % pro α-casein a 76,3 % pro dephosphorylovaný protein oproti 68,2 % a 56,4 % v monodimenzionálním režimu.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizovaná on-line 2D LC zvyšuje efektivitu a reprodukovatelnost proteomických analýz.
• Využití odlišných pH zlepšuje selektivitu a ortogonalitu separace.
• Možnost detekce a kvantifikace posttranslačních modifikací.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může zahrnovat optimalizaci modulace, integraci vysokorychlostních MS technik, rozšíření na komplexní proteomy a kvantitativní profilování.

Závěr

On-line RP-LC×RP-LC spojená s PDA a IT-TOF MS prokázala vysokou kapacitu, citlivost a robustnost v analýze proteinových izoform, což otevírá cestu k aplikacím v proteomice a biomedicínském výzkumu.

Reference

1. Gorg A, Weiss W, Dunn MJ, Proteomics 2004, 4, 3665–3685.
2. Rabilloud T, Proteomics 2002, 2, 3–10.
3. Beranova-Giorgianni S, Trends Anal Chem 2003, 22, 273–281.
4. Reinders J, et al., J Proteome Res 2006, 5, 1543–1554.
5. Gilar M, Olivova P, Daly AE, Gebler JC, J Sep Sci 2005, 28, 1694–1703.
6. Schley C, et al., J Proteome Res 2006, 5, 2760–2768.
7. Bushey MM, Jorgenson JW, Anal Chem 1990, 62, 978–984.
8. Liu Z, Patterson DG, Lee ML, Anal Chem 1995, 67, 3840–3845.
9. Gu H, Huang Y, Carr PW, J Chromatogr A 2011, 1218, 64–73.