Analysis of E.coli Tryptic Digest and Intact Protein Using the Agilent 1290 Infi nity 2D-LC Solution with Diode Array Detection and Q-TOF LC/MS

Význam tématu

Komplexita biologických vzorků v proteomice vyžaduje vysoce výkonné separační techniky. Kombinovaná dvoudimenzionální kapalinová chromatografie (LC×LC) s ortogonálními fázemi dokáže významně zvýšit špičkovou kapacitu a tím i rozlišení tisíců proteinových peptidů a intact proteinů v jednom běhu. Tento přístup zlepšuje podrobné charakterizace vzorků pro výzkum, diagnostiku a průmyslovou kontrolu kvality.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat použití přístrojového uspořádání Agilent 1290 Infinity 2D-LC kombinovaného se silně kationtovou výměnou (SCX) v první dimenzi a reverzní fází (RPLC) ve druhé dimenzi pro analýzu tryptických štěpů a intact proteinů z E. coli lysátu. Studie zkoumala různé doby gradientu první dimenze (75, 150 a 225 minut) a vyhodnotila špičkovou kapacitu a kvalitu detekce UV-DAD a Q-TOF MS.

Použitá metodika

Ultrafialové metody a MS detekce byly provedeny s úpravami mobilních fází:

• Pro DAD: 0,1 % fosforečná kyselina ve vodě
• Pro MS: 0,1 % kyselina mravenčí ve vodě

První dimenze: SCX kolona Agilent Bio SCX, pH 3,0 (digest) nebo pH 5,4 (intakt), gradient NaCl v časech 75/150/225 min.
Druhá dimenze: RPLC kolona ZORBAX 300SB-C18, vysokotlaké gradienty (flow 3–3,5 mL/min), modulační čas 0,5 minuty s 40 µL smyčkami.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity 2D-LC Solution se dvěma binárními pumpami a modulátorem
• Agilent 1290 Infinity Autosampler a termostatované kolony
• Agilent 1290 Infinity Diode Array Detector (DAD)
• Agilent 6530 Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS
• Software: OpenLAB CDS ChemStation, MassHunter (Data Acquisition, BioConfirm, Spectrum Mill), GC Image LC×LC Edition

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza tryptického digestu ukázala lineární nárůst špičkové kapacity v první dimenzi ze 75 na 225 min (z přibližně 1 927 na 3 750). Po korekci ortogonality (faktor ~0,6) byly praktické hodnoty 1 156 až 2 250. MS detekce při 8 spektrách/s umožnila identifikaci klíčových peptidů (např. elongation factor Tu, chaperonin) a intact proteinů s dekonvoluovanými molekulovými hmotnostmi. Vysoké koncentrace NaCl v první dimenzi vyžadovaly periodické čištění MS zdroje.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní profilace proteomů s vysokou rozlišovací schopností
• Simultánní analýza intact proteinů a peptidů v jednom systému
• Automatizace běhů a snadná přechodnost mezi UV a MS detekcí
• Využití v proteomice, biomarkerové analýze, QA/QC v biotechnologiích

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření vysokorychlostních MS detektorů s vyššími datovými výkony, pokročilých modulací a on-line clean-up rutin pro redukci solných složek. Další kroky vedou k integraci umělé inteligence pro automatizované zpracování dat a prediktivní analýzu proteomických vzorků.

Závěr

Agilent 1290 Infinity 2D-LC spojená s DAD a Q-TOF MS nabízí robustní a vysoce ortogonální separaci pro komplexní proteomické aplikace. Zvýšení špičkové kapacity a možnost identifikace peptidů i intact proteinů v jediném experimentu posouvá hranice citlivosti a informativnosti analýz.

Reference

1. François I., Sandra K., Sandra P. Comprehensive liquid chromatography: fundamental aspects and practical considerations - a review. Analytica Chimica Acta, 2009, 64, 14–31.
2. Sandra K., et al. Highly efficient peptide separations in proteomics. J. Chromatogr. B, 2009, 877, 1019–1039.
3. Vanhoenacker G., et al. Analysis of monoclonal antibody digests with the Agilent 1290 Infinity 2D-LC Solution. Agilent Technologies Application Note, 2013, 5991-2880EN.
4. Vanhoenacker G., et al. Tryptic digest analysis using the Agilent 1290 Infinity LC System. Agilent Technologies Application Note, 2009, 5990-4031EN.
5. Blumberg L. M. Linear peak capacity of a comprehensive multidimensional separation. J. Sep. Sci., 2008, 31, 3352–3357.
6. Blumberg L. M. Multidimensional Gas Chromatography: Theoretical Considerations. In: Comprehensive Chromatography in Combination with Mass Spectrometry; Mondello L. (ed.). Wiley, 2011; pp. 13–63.