Advancing Host Cell Protein Analyses Through the Combined Use of Microscale 2D RP/RP with CSH C18 and Ion Mobility Enabled MS Detection

Význam tématu

Analýza hostitelských proteinů (HCP) je nezbytná pro zajištění čistoty bioterapeutik. Nízká úroveň HCP (<10 ppm) vyžaduje vysoce citlivé a vysoce rozlišovací chromatografické metody spojené s hmotnostní spektrometrií. Kombinace dvourozměrné reverzní fáze (2D RP/RP) v mikroskálovém měřítku s novými stacionárními fázemi a iontovou mobilitou významně zvyšuje schopnost detekovat a kvantifikovat stopové HCP příměsi.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat tradiční 2D RP/RP chromatografii s C18 stacionární fází a MS E detekcí s novým uspořádáním využívajícím CSH C18 v druhé dimenzi a HDMS E. Autoři sledovali možnost analyzovat až pětkrát vyšší hmotové zatížení peptidů a minimalizovat šíření píků při analýze 1 mg trypsinového digestu pro dosažení dolních limitů detekce kolem jednotek ppm.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC M-Class System s CH-A 20 cm Column Heater
• ACQUITY UPLC M-Class CSH C18 kolona (300 µm × 150 mm, 1,7 µm, 130 Å)
• Symmetry C18 2D HCP Trap kolona (300 µm × 25 mm, 5 µm, 100 Å)
• XBridge Peptide BEH C18 kolona (1,0 × 50 mm, 5 µm, 300 Å)
• SYNAPT G2-S hmotnostní spektrometr s microscale ESI a iontovou mobilitou

Použitá metodika

Monoklonální protilátka IgG1K byla redukována, alkylována a digestována trypsinem. 2,5 µg/µl digestu bylo upraveno na pH ~10 a doplněno referenčním proteinem rabbit glycogen phosphorylase (4 fmol/µl). První dimenze probíhala na vysokém pH (ammonium formiát) a druhá na nízkém pH (formická kyselina) v 10 frakcích. V druhé dimenzi byla porovnána běžná C18 a CSH C18 při hmotovém zatížení až 1 mg. Detekce využívala HDMS E se zvýšeným rozlišením a iontovou mobilitou.

Hlavní výsledky a diskuse

CSH C18 minimalizuje nežádoucí interakce a šíření píků při vysoké náložnosti, což umožňuje analyzovat 1 mg digestu a posouvá limit detekce HCP na jednotky ppm. Porovnání chromatogramů ukázalo výrazně ostřejší píky a rozlišení i při 5násobném zatížení oproti klasické C18. Kombinace s HDMS E eliminovala spektrální překryvy a zlepšila korelaci prekurzor–fragment.

Přínosy a praktické využití metody

• Detekce nízkoppm HCP impurit v komplexních bioterapeutikách
• Zvýšená hmotová nálož bez ztráty rozlišení
• Vysoký vrcholový výkon (>2500 teoretických vrcholů) v mikroskálovém formátu
• Rychlá kvantifikace pomocí Hi3 přístupu a jedno-bodové kalibrace

Budoucí trendy a možnosti využití

Mikroskálová 2D RP/RP chromatografie s CSH C18 a iontovou mobilitou slibuje další rozvoj v analýze biologických proteinů. Potenciál pro automatizaci, integraci do procesů QA/QC a rozšíření na další typy vzorků (např. komplexní proteomy) otevírá nové aplikace ve farmaceutickém i akademickém výzkumu.

Závěr

Implementace CSH C18 ve druhé dimenzi 2D RP/RP a HDMS E detekce významně posouvá hranice HCP analýzy. Umožňuje vyšší hmotová zatížení, lepší rozlišení a nižší limity detekce, což vede k trojnásobnému nárůstu identifikovaných HCP a odhalení impurit na úrovni 2–6 ppm.

Reference

1. Doneanu et al., MAbs 2012, 4(1), 24–44
2. Schenauer et al., Anal Biochem 2012, 428(2), 150–157
3. Schenauer et al., Biotechnol Prog 2013, 29(4), 951–957
4. Lauber et al., Anal Chem 2013, 85(14), 6936–6944
5. Gilar et al., J Sep Sci 2005, 28(14), 1694–1703
6. Lauber et al., Waters Application Note 720004934EN, 2014
7. Lauber et al., Waters Application Note 720005047EN, 2014
8. Thompson & Stapels, Bioanalysis Zone Webcast WEBC134723094, 2012
9. Silva et al., Mol Cell Proteomics 2006, 5(4), 589–607
10. Silva et al., Mol Cell Proteomics 2006, 5(1), 144–156