Quantification of eleven antimycotics in human serum by TurboFlow chromatography coupled to high-resolution accurate-mass Orbitrap mass spectrometry for clinical research

Význam tématu

Antimykotika představují klíčové léčebné prostředky s úzkým terapeutickým rozsahem a značnou variabilitou farmakokinetiky mezi pacienty. Rychlé a přesné stanovení jejich koncentrace v séru je nezbytné pro optimalizaci dávkování, minimalizaci toxicit a účinnou kontrolu mykotických infekcí.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky bylo zavést a ověřit analytickou metodu pro kvantifikaci jedenácti antimykotik (5-flucytosin, amphotericin B, anidulafungin, fluconazol, isavuconazol, itrakonazol, ketokonazol, micafungin, OH-itrakonazol, posakonazol, vorikonazol) v lidském séru určenou pro klinický výzkum.

Použitá metodika a instrumentace

Postup kombinoval jednoduchou precipitaci proteinů s online čištěním vzorku

• Příprava vzorku: 50 µl séra, precipitace s 100 µl směsi obsahující izotopové interní standardy.
• Online cleanup: TurboFlow Cyclone MCX-2 kolona (0,5×50 mm) na systému Thermo Scientific™ Transcend™ II TLX-1.
• Chromatografická separace: analytická kolona Hypersil GOLD (50×2,1 mm, 1,9 µm) při 30 °C, celkový čas analýzy 4 minuty.
• Detekce: Q Exactive™ Focus Orbitrap vysokého rozlišení (FullMS, R=70 000 FWHM při m/z 200), HESI pozitivní ionizace, rozsah m/z 110–1300.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala:

• Lineární odezvu v celém kalibračním rozmezí s R² > 0,995.
• Nižší mez kvantifikace (LLOQ) s poměrem signál/šum ≥ 7 a požadovanou přesností a opakovatelností (intra- a interdenní ≤ 16,6 % pro LLOQ a ≤ 7,1 % pro QC).
• Účinné potlačení nosného efektu díky použití izotopových interních standardů (normalizovaný matriční faktor CV ≤ 9,2 %).
• Nízké carryover (< 20 % LLOQ signálu, < 5 % signálu ISTD).
• Stabilitu analyzátů po 5 týdnů při −20 °C a −80 °C; autosampler stabilitu po 24 h při 10 °C. Benchtop stabilita některých látek omezena na < 6 h.
• Diluce vzorků umožňují věrné stanovení až 5násobného překročení ULOQ pro většinu analyzátů, s výjimkou amphotericin B.

Přínosy a praktické využití metody

Tato metoda nabízí rychlou (< 5 min), robustní a citlivou analýzu jedenácti antimykotik v jediném běhu. Online příprava vzorku s TurboFlow technologií zkracuje laborantní práci a snižuje náklady na spotřební materiál. Vysoké rozlišení MS umožňuje snadné rozšíření panelu stanovených látek bez změny nastavení měření.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření panelu antifungálních látek a jejich metabolitů, automatizace přípravy vzorků a integrace s informatikou klinického výzkumu. Využití umělé inteligence pro automatickou interpretaci dat a zajištění kvality výsledků zvýší efektivitu diagnostiky a personalizované terapie.

Závěr

Popsaná metoda splňuje nároky klinického výzkumu na citlivost, přesnost a rychlost stanovení antifungálních léčiv v lidském séru. Kombinace proteinové precipitace, online TurboFlow čištění a vysokorozlišovací Orbitrap MS představuje vhodný nástroj pro terapeutické monitorování antifungik.

Reference

• Claudio De Nardi, Carina Schuster, Michael Vogeser. Quantification of eleven antimycotics in human serum by TurboFlow chromatography coupled to high-resolution accurate-mass Orbitrap mass spectrometry for clinical research. Technical Note No. 73187, Thermo Fisher Scientific, 2019.