Quantification of nine antimycotic drugs in human plasma or serum by LC-HRAM(MS) for clinical research

Význam tématu

Antimykotika jsou klíčová pro léčbu a prevenci plísňových infekcí, zejména u imunokompromitovaných pacientů. Mají úzké terapeutické rozmezí a variabilní farmakokinetiku, což vyžaduje přesné stanovení krevních koncentrací k zajištění účinnosti a minimalizaci toxicity. V klinickém výzkumu i terapeutickém monitoringu je proto nezbytné spolehlivé, rychlé a selektivní analytické řešení pro kvantifikaci více látek v jediném běhu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat kvantitativní metodu pro simultánní stanovení devíti antimykotik v lidské plazmě či séru pomocí kapalinové chromatografie spojené s vysokým rozlišením hmotnostní spektrometrie (LC-HRAM MS). Metoda je optimalizována pro klinický výzkum a terapeutický monitoring na přístrojovém uspořádání Thermo Scientific Vanquish Duo UHPLC a Q Exactive Plus Orbitrap.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Duo s přímou injekcí
• MS: Thermo Scientific Q Exactive Plus hybridní kvadrupól-Orbitrap s HESI-II zdrojem v pozitivním módu
• Software: TraceFinder 5.1 pro zpracování dat
• Kit ClinMass TDM Platform s Add-On Set Antimycotics od RECIPE Chemicals + Instruments

Použitá metodika

Vzorky (50 µl plazmy/séra) byly připraveny offline proteinovou precipitací v přítomnosti stabilně značených interních standardů. Po centrifugaci se 100 µl supernatantu injektovalo (10 µl) na analytickou kolonu při 40 °C. Chromatografie probíhala gradientem (0–3,5 min) při konstantním průtoku 0,6 ml/min. Detekce byla realizována v režimu FullMS-ddMS2 pro kvantifikaci a selektivní fragmentační potvrzení.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala:

• Lineární odezvu v celém rozsahu kalibrace (kvadratická pro ketokonazol) s vážením 1/×
• LLOQ v rozsahu 0,013–0,461 ng/ml pro jednotlivé analyty
• Bias zpětně stanovených koncentrací v kalibrátorech vždy ≤±10 % (≤±15 % pro LLOQ)
• Žádné překážky (carryover) při injekci prázdných vzorků
• Accuracy kontrolních vzorků: bias –2,0 % až +4,2 %
• Intra- denní i mezi-denní přesnost (%CV) <8,2 % a <6,4 %

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší následující výhody:

• Rychlá příprava vzorků jednoduchou precipitací
• Krátký chromatografický běh (3,5 min) pro vysokou průchodnost
• Vysoká selektivita a citlivost díky HRAM Orbitrap
• Možnost simultánního sledování devíti antimykotik
• Vhodné pro TDM a farmakokinetické studie

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje zahrnují rozšíření panelu látek, implementaci online SPE pro automatizaci, integraci s klinickými informačními systémy a využití vysokorozlišovací MS pro multi-omics přístupy. Dále je perspektivní rozvoj metodiky pro real-time monitoring a miniaturizaci přípravy vzorků.

Závěr

Popisovaná LC-HRAM MS metoda poskytuje robustní, přesnou a rychlou kvantifikaci devíti antimykotik v lidské plazmě či séru. Splňuje požadavky klinického výzkumu a TDM na citlivost, selektivitu a reprodukovatelnost.