Confident quantitation for every user: immunosuppressants in human blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry for clinical research

Význam tématu

Monitorování koncentrací imunosupresiv u pacientů po transplantacích je klíčové pro optimalizaci dávkování, prevenci toxických efektů a minimalizaci rizika odmítnutí štěpu. Tradiční imunotesty sice nabízejí jednoduché provedení, avšak LC-MS/MS metody poskytují vyšší selektivitu, specifitu a citlivost, což je nezbytné pro přesné klinické rozhodování.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo zavést a analyticky validovat metodu kvantifikace čtyř běžně sledovaných imunosupresiv (tacrolimus, sirolimus, everolimus a cyklosporin A) v lidské krvi pomocí Thermo Scientific™ TSQ Quantis™ triple kvadrupólového hmotnostního spektrometru ve spojení se systémem Transcend™ LX-2.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorce krve o objemu 100 µL byly připraveny offline prespitací bílkovin přidáním 150 µL 0,1 M roztoku ZnSO₄ a 200 µL metanolu obsahujícího izotopově značené interní standardy. Supernatant byl po centrifugaci začerpán na UHPLC:

• Systém: Thermo Scientific Transcend LX-2 se dvěma paralelními kanály
• Kolona: Hypersil GOLD 50 × 2,1 mm, 1,9 µm, 60 °C
• Mobilní fáze A: voda + 10 mM formiátu amonného + 0,1 % kyseliny mravenčí
• Mobilní fáze B: methanol + 10 mM formiátu amonného + 0,1 % kyseliny mravenčí
• Mobilní fáze C: acetonitril/aceton/2-propanol (60/20/20 v/v/v)
• Gradient: 3,5 min při 0,6 mL/min, separace a reequilibrační fáze
• Injekční objem: 25 µL
• Detekce: TSQ Quantis s HESI v pozitivním módu, Selected Reaction Monitoring (dva SRM přechody pro identifikaci a kvantifikaci)
• Software: Thermo TraceFinder 4.1

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrační křivky vykazovaly lineární závislost signálu na koncentraci v rozsazích 2,19–929 ng/mL s vážením 1/x a korelačním koeficientem R² > 0,999. Mezi nominálními a stanovenými hodnotami byl bias v rozmezí –6,3 % až +1,2 %. Intra-denní přesnost (%CV) byla nižší než 7,3 %, mezidenní přesnost nepřesáhla 6,8 %. Carryover bylo zanedbatelné, žádný analyzovaný vzorek po nejvyšším kalibrátoru neprokázal pozůstatky.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Rychlou analýzu (celkový runtime 3,5 min)
• Jednoduchou přípravu vzorku bez nutnosti online čistění
• Vysokou propustnost díky duálnímu kanálovému UHPLC
• Vynikající citlivost a robustnost pro klinické výzkumné aplikace

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování zahrnuje rozšíření panelu sledovaných látek, automatizaci přípravy vzorků, vyšší míru multiplexace a integraci výsledků do digitálních systémů pro monitorování pacienta v reálném čase. Kombinace s dalšími omickými přístupy nebo point-of-care zařízeními může dále zkvalitnit personalizovanou medicínu.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda pro kvantifikaci imunosupresiv v lidské krvi je rychlá, přesná a opakovatelná. Splňuje přísné požadavky klinického výzkumu na citlivost, selektivitu a přesnost a umožňuje efektivní rutinní analýzu ve výzkumných laboratořích.

Reference

• De Nardi C, Brambilla P, Brambilla M, Fania C. Confident quantitation for every user: immunosuppressants in human blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry for clinical research. Technical Note 65439, Thermo Fisher Scientific; 2019.
• Chromsystems Instruments & Chemicals GmbH. MassCheck® 0081 lot #2317 calibrators and controls.