Quantification of immunosuppressants in human blood by LC-HRAM mass spectrometry for clinical research

Význam tématu

Po transplantaci orgánu je nezbytné přesně monitorovat koncentrace imunosupresiv, aby se zabránilo odmítnutí transplantátu nebo nežádoucí toxicitě. Kapalinová chromatografie spojena s vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií (LC-HRAM MS) nabízí vyšší citlivost a selektivitu než konvenční imunotesty.

Cíle a přehled studie

• Vyvinout a ověřit analytickou metodu pro kvantifikaci takrolimu, sirolimu, everolimu a cyklosporinu A v lidské krvi.
• Zavést jednoduchou offline preparaci vzorku s proteinovou precipitací a vnitřními standardy.
• Posoudit linearitu odezvy, hranici kvantifikace (LLOQ), nosnost, přesnost, pravdivost a reálnou opakovatelnost metody.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: 100 µl krve, přidání izotopově značených standardů, precipitace proteinů, centrifugace.
• Chromatografie: Thermo Scientific Vanquish Flex Duo UHPLC s kanálem pro online SPE a analytickou kolonu z ClinMass kit, běh 2 minuty.
• Detekce: Q Exactive Plus Quadrupole-Orbitrap MS se HESI v pozitivním módu, akvizice Full MS a PRM. Data zpracována v TraceFinder 5.1.

Hlavní výsledky a diskuse

• Lineární odezva s R2 nad 0,99 pro všechny analyty v obou režimech.
• LLOQ v rozsahu 0,244–2,27 ng/ml pro jednotlivé látky, s CV<20 % při LLOQ.
• Bias mezi nominální a vypočtenou koncentrací v rámci ±10 % v celém rozsahu kalibrace.
• Žádný carryover detekován u žádného analyta.
• Intraassay precize CV<5,4 %; interassay CV max. 6,5 %. Pravdivost ověřena externími kontrolami s bias do ±6,1 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a robustní analýza s ultrarychlou chromatografií a vysokorozlišovací detekcí.
• Vysoká selektivita díky paralelnímu sledování fragmentů (PRM).
• Jednoduchá a reprodukovatelná offline preparace vhodná pro klinický výzkum.
• Metoda poskytuje spolehlivá data pro terapeutické monitorování a optimalizaci dávek imunosupresiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření spektra analyzovaných imunosupresiv nebo dalších terapeutických sloučenin.
• Automatizace preparativních kroků pro vyšší průchodnost vzorků.
• Integrace s laboratorními informačními systémy a umělou inteligencí pro rychlou validaci a interpretaci dat.

Závěr

Popisovaná metoda kombinuje jednoduchou přípravu vzorku, ultrarychlou separaci a vysoce selektivní HRAM detekci pro účinnou kvantifikaci imunosupresiv. Splňuje požadavky na linearitu, citlivost, přesnost a opakovatelnost pro klinický výzkum.

Použitá instrumentace

• Vanquish Flex Duo UHPLC (Thermo Scientific)
• Q Exactive Plus quadrupole-Orbitrap mass spectrometer (Thermo Scientific)
• TraceFinder 5.1 software (Thermo Scientific)
• ClinMass LC-MS/MS Complete Kit for Immunosuppressants in Blood (RECIPE Chemicals + Instruments GmbH)