Quantification of immunosuppressants in human whole blood by liquid chromatography-tandem mass spectrometry for clinical research

Význam tématu

Pravidelná a přesná kvantifikace imunosupresivních léčiv je nezbytná pro optimalizaci léčby pacientů po transplantacích. Imunosupresiva jako cyklosporin A, takrolimus, sirolimus a everolimus mají úzký terapeutický index, velkou meziosobní variabilitu a potenciál pro závažné nežádoucí účinky při pod- nebo předávkování.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat robustní LC-MS/MS metodu pro simultánní kvantifikaci čtyř klíčových imunosupresiv v lidské plné krvi. Metoda byla zaměřena na minimalizaci offline přípravy vzorku a maximalizaci analytické výkonnosti v rámci klinického výzkumu.

Použitá metodika

Vzorky lidské plné krve byly připraveny jednoduše precipitací proteinů za přítomnosti isotopově značených interních standardů. Po centrifugaci následovalo online SPE na systému Transcend II TLX-1. Chromatografická separace probíhala na SPE cartridgi a analytickém column od RECIPE, přičemž celková doba běhu činila 2 minuty.

Detekce byla realizována na triple kvadrupólovém hmotnostním spektrometru TSQ Endura s heated electrospray ionizací v pozitivním režimu. Pro každý analyzát byly sledovány dvě SRM tranzice – kvantifikační a potvrzovací.

Validace metody zahrnovala stanovení mezí kvantifikace (LLOQ), linearity rozsahů, analytické přesnosti (trueness) a precize (intra- a inter-assay) s využitím Proficiency Test vzorků z INSTAND e.V.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Transcend II TLX-1 systém pro online SPE
• Thermo Scientific TSQ Endura triple kvadrupólový hmotnostní spektrometr s HESI zdrojem
• RECIPE SPE cartridge a analytický column
• Thermo Scientific TraceFinder software verze 3.3 pro akvizici a zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vysokou linearitu v rozsazích:

• Cyklosporin A: 25,8–1243 ng/ml
• Everolimus: 1,45–49,4 ng/ml
• Sirolimus: 1,62–52,9 ng/ml
• Tacrolimus: 1,37–45,1 ng/ml

Mezní koncentrace LLOQ byly 14,0 ng/ml pro cyklosporin A, 0,85 ng/ml pro everolimus, 1,87 ng/ml pro sirolimus a 0,31 ng/ml pro tacrolimus. Korelační koeficienty R2 překročily hodnotu 0,99.

Bias mezi nominální a naměřenou koncentrací v kontrolních vzorcích se pohyboval mezi –21,5 % a 15,1 %. Intra-assay precize (CV) byla vždy nižší než 9,9 %, inter-assay CV nepřesáhla 12,9 % pro žádný z analyzovaných látek.

Přínosy a praktické využití metody

• Simultánní stanovení čtyř imunosupresiv v jednom běhu
• Rychlá analýza (2 minuty) s minimální přípravou vzorku
• Vysoká citlivost, linearita a opakovatelnost výsledků
• Vhodné pro klinický výzkum a monitorování terapie pacientů

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda je perspektivní pro rozšíření analytického panelu o další léky s úzkým terapeutickým indexem. Dále lze uvažovat o plné automatizaci přípravy vzorků, integraci do laboratorních informačních systémů (LIMS) a aplikacích v personalizované medicíně a farmakokinetických studiích.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda poskytuje rychlé, robustní a validované řešení pro kvantifikaci cyklosporinu A, everolimu, sirolimu a tacrolimu v lidské plné krvi. Splňuje požadavky klinického výzkumu na citlivost, linearitu, přesnost a precizi a nabízí efektivní nástroj pro monitorování léčebných režimů.