Deep Proteomic Coverage Using Fast and Sensitive FAIMSDevice Coupled to a Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribid Mass Spectrometer

Význam tématu

Analýza hlubokého proteomu je klíčová pro odhalení nízkoodstupňových proteinů v komplexních vzorcích. V praxi je však limitujícím faktorem chemický šum a nízká čistota iontového signálu v MS. Integrace FAIMS zařízení umožňuje selektivní filtrování a obohacení vícenásobně nabitých peptidů v plynném stadiu, čímž se zvyšuje citlivost a kvalita dat bez výrazné ztráty času při skenování.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo porovnat vliv iontového transitního času ve FAIMS na výkon masového spektrometru typu Orbitrap Fusion a Fusion Lumos při analýze HeLa tryptického digestu. Autoři hodnotili variabilní υrovně transitního času (40 ms vs 0,1 ms), optimalizovali kompenzační napětí (CV) a rychlost střídání CV (Turbo CV switching) a sledovali počet MS/MS skenů, peptide spectrum matches (PSM), identifikovaných peptidů a proteinů.

Použitá metodika a instrumentace

Byl použit standardizovaný HeLa digest (1 μg) separovaný na C18 kolonce EASY-nLC 1000 během 1,5 hodiny. Zařízení FAIMS Pro bylo integrované na Orbitrap Fusion a Fusion Lumos s paralelizovanou analýzou v Orbitrap a iontové pasti. Data-dependent akvizice s HCD fragmentací probíhala při rozlišení MS1 60 000, MS2 v režimu rapid scan v iontové pasti a s APD modulem. Kompenzační napětí bylo testováno v rozsahu od –30 V do –90 V. Testovány byly časy iontové injekce 10–35 ms a různé kombinace CV (2–5 CV) s Turbo CV switching.

Hlavní výsledky a diskuse

• Snížení transitního času z 40 ms na 0,1 ms odstranilo časový overhead mezi CV přepínači bez snížení intenzity MS1 signálu.
• Turbo CV switching se 4 CV (–48, –55, –65, –72 V) přinesl až 53 000 unikátních peptidů a 6 600 proteinů v jediném běhu na Orbitrap Fusion.
• FAIMS snižuje celkovou iontovou intenzitu přibližně 2×, ale zvyšuje čistotu MS1 signálu a poměr peptidů k chemickému pozadí.
• Optimální CV pro DDA analýzu byly –50 V a –70 V, které obohacují 2+ a 3+ nabité peptidy.
• Nejlepší čas injekce v iontové pasti byl 20 ms, kdy počet identifikací peptidů dosáhl až 40 523 oproti 37 003 bez FAIMS.
• Dynamické přizpůsobení CV podle retenční doby (CV-RT) vedlo k 51 785 peptidům, což potvrzuje přínos adaptivního přepínání.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zvýšení hloubky proteomické analýzy ve zlomku času.
• Možnost pracovat s FAIMS při téměř 100 % duty cycle bez zhoršení výkonu MS.
• Zvýšená citlivost na nízkoodstupňové proteiny a lepší kvalita dat pro kvantitativní i kvalitativní studie.
• Uplatnění v laboratorní rutinní praxi, výzkumu biomarkerů, QA/QC a farmaceutické analytice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zkracování transitního času a optimalizace RF cyklů pro minimalizaci ztrát iontů.
• Integrace s režimy DIA pro ještě vyšší datovou hustotu a reprodukovatelnost.
• Pokročilé algoritmy pro dynamické řízení CV v reálném čase přímo během chromatografického běhu.
• Vývoj nových materiálů a tvarů elektrod FAIMS pro ještě vyšší selektivitu a přenosnost iontů.

Závěr

Studie prokázala, že použití citlivého a rychlého FAIMS zařízení s optimalizovaným přepínáním CV a minimalizovaným transitním časem významně zvyšuje počet identifikovaných peptidů a proteinů bez ztráty rychlosti akvizice. Metoda nabízí robustní cestu k hluboké proteomice v akademickém i průmyslovém prostředí.

Reference

• Prasad S, Belford MW, Bailey D, et al. Deep Proteomic Coverage Using Fast and Sensitive FAIMS Device Coupled to a Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribid Mass Spectrometer. Thermo Fisher Scientific White Paper, 2018.