Reliable and Deep Proteome Coverage by Gas-Phase Fractionation of Peptides with a FAIMS Pro Interface on a Modified Quadrupole Orbitrap

Význam tématu

Proteomické analýzy složitých biologických vzorků čelí značné výzvě v podobě vysoké dynamiky koncentrací a chemického pozadí při hmotové spektrometrii.
Tradiční offline frakcionační postupy vyžadují dodatečné kroky, vyšší množství vzorku a jsou časově náročné.
Nasazení metody FAIMS (High-Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry) umožňuje v plynném stavu rozdělit ionty peptidů dle jejich fyzikálně-chemických vlastností přímo v přístroji, čímž se snižuje složitost vzorku a zvyšuje citlivost detekce.

Cíle a přehled studie / článku

Studie si klade za cíl ukázat přínos rozhraní Thermo Scientific FAIMS Pro v kombinaci s novým Orbitrap Exploris 480 pro data-dependent proteomické experimenty.
Autoři optimalizovali nastavení metody zahrnující různé délky gradientu (30, 60, 90 min), průtokové podmínky (nano- i kapilární tok) a kompenzační napětí (CV), včetně střídání dvou či tří hodnot CV v rámci jednoho běhu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek:

• Trypsinový HeLa Protein Digest Standard (Thermo Scientific Pierce), koncentrace 500 ng/µl.

Chromatografie:

• Nano-LC: EASY-nLC 1200, Acclaim PepMap C18 75 μm × 50 cm, 2 μm, gradienty 30/60/90 min při 300 nl/min.
• Kapilární tok: Acclaim PepMap C18 150 μm × 15 cm, 2 μm, 30 min při 1 000 nl/min.

Hmotová spektrometrie:

• Orbitrap Exploris 480 s rozhraním FAIMS Pro, režim DDA, FAIMS standardní nastavení dispersion voltage vypnuto, CV variabilní (−40, −55, −65 V) s možností přepínání.
• MS1: m/z 350–1 200, rozlišení 60 000, AGC 300 %, TopN 20/15.
• MS2: rozlišení 15 000, šířka izolačního okna 1,4–1,6 m/z, NCE 29 %, max. injekční čas 22/45 ms, AGC 75 %.

Software a analýza dat:

• Proteome Discoverer 2.4, SEQUEST HT; FDR 1 % pro proteiny i peptidy; fixní modifikace karbamidomethylace, dynamické modifikace metionin oxidace, Asn/Glu deamidace, N-terminální acetylace.

Hlavní výsledky a diskuse

Single CV experimenty:

• Ve srovnání s chodem bez FAIMS klesl počet identifikovaných peptidů, ale počet proteinových skupin vzrostl až o 15 % (nano-flow).
• Optimální CV pro vyšší m/z hodnoty je −40 V, pro nižší m/z pak −65 V.

Střídání CV během běhu:

• Přepínání mezi dvěma CV (−40 V/−65 V) obnovilo počet peptidových identifikací a dále zvýšilo počet proteinů.
• Střídání tří CV (−40 V/−55 V/−65 V) v delších gradientech (90 min) přineslo nejhlubší pokrytí proteomu s minimální vzájemnou redundancí (pouze 4 % společných identifikací).

Capillary flow:

• 30minutový gradient při 1 000 nl/min s FAIMS zlepšil identifikaci proteinů až o 25 % i v single CV módu.
• Střídání CV pro tak krátké gradienty nebylo zásadní, nejvyšší nárůst zaznamenán při CV −40 V.

Přínosy a praktické využití metody

FAIMS Pro poskytuje efektivní gas-phase frakcionaci bez nutnosti offline kroků, snižuje chemické rušení a zvyšuje citlivost pro nízkoabundantní peptidy.
Postup je kompatibilní s různými průtokovými režimy i délkami gradientů a nevyžaduje navýšení doby analýzy či složitější přípravy vzorku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření na kvantitativní experimenty s multiplexními značkami (TMT/CEASAR) díky snížení ko-izolace reporter-iontů.
Dynamické optimalizace CV v reálném čase pro různé typy vzorků a malého množství materiálu.
Kombinace s dalšími iontově‐mobilními technikami a nárůst hloubky proteomického pokrytí u klinických i environmentálních vzorků.

Závěr

Implementace FAIMS Pro na Orbitrap Exploris 480 významně rozšiřuje proteomické pokrytí, umožňuje rychlejší a citlivější analýzu a eliminuje řadu offline frakcionačních kroků. Tato metoda je univerzální pro nano- i kapilární separace a nabízí perspektivu pro budoucí kvantitativní i kvalitativní studie.

Reference

• A. Hebert et al., Anal Chem 2018, 90, 9529–9537.
• Pfammatter et al., Mol Cell Proteomics 2018, 17(10), 2051–2067.