Comprehensive Evaluation of Bottom-up Proteomics using an Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer with FAIMS Pro Interface

Význam tématu

Bottom-up proteomika umožňuje identifikaci a kvantifikaci tisíců proteinů v komplexních vzorcích štěpením proteinů na peptidy a jejich analýzou pomocí hmotnostní spektrometrie. Nasazení FAIMS Pro Interface přináší další dimenzi selektivity díky plynné fázi iontové mobility, čímž zvyšuje citlivost, snižuje interferenci a rozšiřuje pokrytí proteomu.

Cíle a přehled studie/článku

Cílem bylo vyhodnotit výkon nového Thermo Scientific FAIMS Pro Interface kombinovaného s Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS pro aplikace bottom-up proteomiky: single-shot analýzy, fosfoproteomiku, reporter ionovou kvantifikaci a chemické crosslinkingové strukturální studie.

Použitá metodika

Vzorky zahrnovaly trypsin digesty lidských buněčných linek (HeLa, 293T), obohacené fosfopeptidy, depleci vysoce abundantních proteinů z plazmy a DSS-crosslinkovaný BSA. LC separace proběhla na Easy-nLC 1200, data-dependent acquisition (DDA) s top-speed režimem (3 s cyklus), Orbitrap full MS a ion trap MS/MS, s pevně nastavenými a kombinovanými kompenzačními napětími (CV) FAIMS Pro.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer
• FAIMS Pro Interface
• Thermo Scientific Easy-nLC 1200
• Thermo Scientific SOLA SPE desaltační destičky
• Thermo Scientific High-Select Fe-NTA Phosphopeptide Enrichment Kit

Hlavní výsledky a diskuse

• Proteomické pokrytí vzrostlo o 10–20 % díky odstranění iontové interference v plynné fázi.
• Single-shot analýza 200 ng HeLa digestu vedla k ~5 000 identifikovaným proteinům za hodinu (12 % nárůst oproti bez FAIMS).
• Analýza 1 µg 293T digestu v 2h běhu identifikovala ~7 000 proteinů při 1 % FDR (nárůst 13 % peptidů).
• Deplece plazmatických vzorků umožnila identifikaci přes 700 proteinů a ~7 000 peptidů během jedné hodiny.
• Fosfoproteomika vykázala lepší selektivitu a snížené potlačení signálu v komplexních vzorcích.
• Kvantitativní TMT11plex analýza prokázala, že >90 % prekurzorů má interferenci <50 % a SPS-MS3 dále zvýšilo přesnost kvantifikace.
• Crosslinkingová studie BSA se zdvojnásobila počet identifikovaných crosslinků a crosslink-spectrum matchů.

Přínosy a praktické využití metody

FAIMS Pro Interface zvyšuje citlivost i selektivitu bottom-up proteomických analýz, umožňuje hlubší průzkum proteomu, přesnější kvantifikaci nízko abundantních posttranslačních modifikací a detailnější strukturální studie protein–protein interakcí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace FAIMS s data-independent acquisition (DIA) a pokročilými chromatografickými knihovnami.
• MS1-based kvantifikace s vysokým rozlišením a cílená proteomika.
• Komplexní analýza PTM kódů a jejich krosstalků.
• Jednoběžné pokrytí celého proteomu v single-shot experimentech.

Závěr

Kombinace Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS a FAIMS Pro Interface představuje výrazný pokrok v bottom-up proteomice. Metoda umožňuje hlubší a přesnější analýzu komplexních vzorků, podporuje široké spektrum aplikací a otevírá nové možnosti pro výzkum a průmyslovou analytiku.

Reference

1. Anal Chem. 2018, 90, 9529.
2. Nat Methods. 2009, 6, 359.
3. Mol Cell Proteomics. 2011, 10, M111.011015.
4. Mol Cell Proteomics. 2014, 13, 3698.
5. Anal Chem. 2013, 85, 11710.
6. J Proteome Res. 2018, 17, 727.
7. Chem Rev. 2015, 115, 2376.
8. Mol Cell Proteomics. 2012, 11, 272.
9. Nat Methods. 2011, 8, 937.
10. Nat Commun. 2018, 9, 5128.
11. Nat Methods. 2018, 15, 440.
12. A streamlined workflow for high-throughput, precise, and comprehensive large-scale quantitative proteomics analysis, ASMS 2018 poster.