Improved Identification, Quantification Accuracy, and Workflow Efficiency using a Modified Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer and Tandem Mass Tags (TMT) Approach

Význam tématu

Quantitativní proteomika s izobarickými značkami TMT umožňuje paralelní měření abundancí proteinů v několika vzorcích v rámci jednoho LC-MS experimentu.
Výzvou jsou přesná kvantifikace při vysokém stupni multiplexace, potlačení interference související s ko-izolovanými ionty a omezená rychlost získávání dat.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyhodnotit, jak modifikace kvadrupól-Orbitrap resonančního spektrometru Exploris 480 ve spojení s FAIMS Pro a algoritmem TurboTMT (ΦSDM) ovlivní identifikaci, kvantifikaci a efektivitu workflow při experimentech TMT MS2.
Studie využila standardizovaný vzorek TMT11plex k porovnání metrik bez FAIMS, s FAIMS a s různými nastaveními rozlišení a filtrů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: Thermo Scientific Pierce TMT11plex Yeast Digest Standard (500 ng), 50min gradient 8–32% ACN, 0,1% FA, 45 °C kolona C18 50 cm.
LC: EASY-nLC 1200; kolona EASY-Spray C18; ionizace EASY-Spray.
MS: Orbitrap Exploris 480; scan MS1 rozlišení 120 000; MS2 rozlišení 45 000 (standardně) vs. 30 000 s TurboTMT; FAIMS Pro CV: –45/–60/–75 V.
Software: Proteome Discoverer 2.3, SEQUEST HT, toleranční okna 10 ppm (MS1), 0,02 Da (MS2), FDR 1%, statická modifikace TMT6plex.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Exploris 480 s FAIMS Pro
• Thermo Scientific EASY-nLC 1200
• EASY-Spray C18 50 cm kolona
• Proteome Discoverer 2.3, SEQUEST HT

Hlavní výsledky a diskuse

• Použití TurboTMT (ΦSDM) zvýšilo počet peptidových a proteinových identifikací až o 10 % při zachování 50min gradientu.
• Integrace FAIMS Pro snížila ko-izolační interferenci až o 20–30 % a zlepšila Interference Free Index na průměrných 65–69 %.
• Reprodukovatelnost měření: ~2 100 proteinů a ~11 000 peptidů na standardním nastavení s CV ~5 %.
• Přidání Precursor Fit filtru zvýšilo specifičnost izolace a dále omezilo kompresi poměrů kvantifikace.

Přínosy a praktické využití metody

Nová kombinace modifikovaného Orbitrapu, FAIMS a TurboTMT umožňuje hlubší průnik do komplexního proteomu a přesnější kvantifikaci v multiplexovaných experimentech.
Významné zrychlení záznamu dat a snížení interference podporuje vysokopropustné workflow pro biologické a klinické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření multiplexace nad 11 kanálů a optimalizace krátkých gradientů.
• Využití dalšího vývoje iontové mobility a real-time decision making.
• Integrace umělé inteligence pro korekci interferenčních artefaktů.
• Aplikace v cílené proteomice a klinických biomarkerech.

Závěr

Kombinace modifikovaného kvadrupól-Orbitrapu Exploris 480 s FAIMS Pro a TurboTMT vede k významnému zlepšení počtu identifikací, kvantifikační přesnosti a efektivity workflow v TMT MS2 experimentech.

Reference

1. Paulo C. A. et al. A Triple Knockout (TKO) Proteomics Standard for Diagnosing Ion Interference in Isobaric Labeling Experiments. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2016;27:1620.
2. Pfammatter S. et al. A Novel Differential Ion Mobility Device Expands the Depth of Proteome Coverage and the Sensitivity of Multiplex Proteomic Measurements. Mol. Cell. Proteomics 2018;17:2051–2067.
3. Schweppe D. K. et al. Characterization and Optimization of Multiplexed Quantitative Analyses Using High-Field Asymmetric-Waveform Ion Mobility Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2019;91(6):4010–4016.
4. Gygi S. P. et al. Web-Based Search Tool for Visualizing Instrument Performance Using the Triple Knockout (TKO) Proteome Standard. J. Proteome Res. 2019;18(2):687–693.