Improved Identification, Quantification Accuracy, and Workflow Efficiency using a Modified Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer and Tandem Mass Tags (TMT) Approach (ASMS)

Význam tématu

Multiplexní kvantitativní proteomika s použitím Tandem Mass Tags (TMT) představuje klíčový přístup pro simultánní stanovení relativních hladin proteinů v mnoha vzorcích. Zvýšení přesnosti kvantifikace a hloubky proteomu je zásadní pro pokročilé biologické aplikace, výzkum a kvalitu analytických postupů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit benefity modifikovaného kvadrupól–Orbitrap Exploris 480 hmotnostního spektrometru v kombinaci s FAIMS Pro rozhraním a pokročilými algoritmy (TurboTMT powered by ΦSDM, Precursor Fit filter) pro TMT11plex MS2 kvantifikaci. Autoři porovnali identifikační a kvantifikační výkonnost se standardními podmínkami.

Použitá metodika a instrumentace

Pro hodnocení byla použita Thermo Scientific Pierce TMT11plex yeast digest standard. Analýza probíhala na systému Thermo Scientific EASY-nLC 1200 s EASY-Spray C18 kolónou (50 cm, zahřátá na 45 °C) a gradientem 8–32 % acetonitrilu během 50 minut. Spektrální data byla snímána na Orbitrap Exploris 480 s FAIMS Pro rozhraním (CV -45, -60, -75, -90 V). Klíčové parametry:

• MS1 rozlišení 120000, MS2 rozlišení 30000–45000
• Použití TurboTMT (ΦSDM) pro zvýšení efektivního rozlišení v oblasti reporter iontů
• Precursor Fit filter pro redukci koizolace a omezování komprese poměrů
• Průtok: EASY-nLC 1200, ionizace: EASY-Spray
• Analýza dat v Proteome Discoverer 2.3 se SEQUEST HT, 1% FDR

Hlavní výsledky a diskuse

• TurboTMT (ΦSDM) zvýšil počet identifikovaných proteinů až o 11 % a peptidů o 19 % při kratších gradientech.
• FAIMS Pro s Precursor Fit filtrem snížil koizolaci rušivých iontů a zlepšil interference free index až o 30 %.
• Přesnost kvantifikace (průměrný CV peptidu 5,4 %) a stabilita nano-LC–MS metody zajišťují opakovatelné výsledky (denní TMT QC).
• Modifikovaná konfigurace umožnila hlubší pokrytí proteomu při zachování vysoké rychlosti analýz.

Přínosy a praktické využití metody

Díky vyšší identifikační schopnosti, lepší přesnosti kvantifikace a kratším dobám analýzy se tato konfigurace osvědčí v rutinní proteomice i náročných výzkumných projektech. Uživatelé mohou dosáhnout vyššího počtu kvantifikovaných proteinů v multiplexních experimentech bez nutnosti prodloužení doby měření.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se zaměří na optimalizaci algoritmů pro zvýšení citlivosti, rozšíření multiplexních značkovacích souprav a integraci s přístupy data-independent acquisition (DIA). Kombinace FAIMS, Deep Learningu a hybridních metod by mohla dále posunout hranice proteomické hloubky a přesnosti.

Závěr

Modifikovaný kvadrupól–Orbitrap Exploris 480 s FAIMS Pro rozhraním a pokročilými nástroji TurboTMT a Precursor Fit výrazně zlepšuje výkonnost TMT11plex MS2 kvantifikace. Studie prokázala vyšší identifikační výtěžek, redukci interference a stabilní kvantifikační přesnost, což přináší významný přínos pro proteomické aplikace.

Reference

• Paulo JA et al. A Triple Knockout (TKO) Proteomics Standard for Diagnosing Ion Interference in Isobaric Labeling Experiments. J Am Soc Mass Spectrom. 2016;27:1620.
• Pfammatter S et al. A Novel Differential Ion Mobility Device Expands the Depth of Proteome Coverage and the Sensitivity of Multiplex Proteomic Measurements. Mol Cell Proteomics. 2018;17:2051–2067.
• Schweppe DK et al. Characterization and Optimization of Multiplexed Quantitative Analyses Using High-Field Asymmetric-Waveform Ion Mobility Mass Spectrometry. Anal Chem. 2019;91(6):4010–4016.
• Gygi SP et al. Web-Based Search Tool for Visualizing Instrument Performance Using the Triple Knockout (TKO) Proteome Standard. J Proteome Res. 2019;18(2):687–693.