Low pg/mL Detection of rHuEPOs in Horse Plasma Employing High-Resolution MS

Význam tématu

Rekombinantní lidský erytropoetin (rHuEPO) je glykoprotein o hmotnosti 30–34 kDa, běžně zneužívaný ke zvýšení výkonnosti ve sportovních a jezdeckých disciplínách. Spolehlivá detekce rHuEPO v biologických matricích je klíčová pro antidopingové kontroly, především vzhledem k omezené době, po kterou jsou infekční formy detekovatelné v plazmě.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem studie bylo vyvinout a ověřit vysoce citlivou a specifickou metodu pro potvrzení a kvantifikaci rHuEPO v koňské plazmě na úrovni nižších pg/mL. Klíčové kroky zahrnovaly:

• Imunoafinitní obohacení rHuEPO pomocí monolitických anti-EPO kolon.
• Digesci a nanoLC separaci peptidů rHuEPO.
• Cílenou analýzu dvou specifických peptidů T6 (VNFYAWK) a T17 (VYSNFLR) pomocí high-resolution MS.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific EASY-nLC nanoLC systém s C18 trap a analytickou kolonu 100 μm × 15 cm
• Thermo Scientific Q Exactive hybridní kvadrupól-Orbitrap
• Monolitické anti-EPO kolony (MAIIA Diagnostics) pro imunoafinitní extrakci
• Software Thermo Scientific Pinpoint pro extrakci chromatogramů a kvantifikaci

Použitá metodika

Imunoafinitní extrakce: Plazma byla naředěna pH neutrálním pufrem a protažena monolitickou anti-EPO kolonou, poté byl rHuEPO eluován centrifugací.

Trypsinová digesce: Proteiny byly redukovány TCEP (7 mM) při 95 °C a digesovány trypsinem (2 μg) při 37 °C po dobu 210 min.

Spiking těžkých peptidů: Do extrahované a digesované plazmy byly přidány 13C/15N označené peptidy T6* a T17* v rozsahu 10 amol až 100 fmol.

Chromatografie a MS analýza: Gradient 5–40 % acetonitrilu s 0,2 % kyselinou mravenčí během 48 min při průtoku 300 nL/min. Metoda střídala dva SIM skeny (140 000 rozlišení) a dvě cílená MS2 měření (35 000 rozlišení) s maximální injekcí 500 ms.

Zpracování dat: Extrakce chromatogramů s 5 ppm tolerancí a posunem až 1 min, výpočet ploch vrcholů na sedmibodově vyhlazených datech.

Hlavní výsledky a diskuse

• Limit detekce rHuEPO v koňské plazmě stanovený na 25 pg/mL (CV = 8 %, n = 3), což představuje čtyřnásobné zlepšení oproti triple-kvadrupólovým SRM metodám.
• Lineární odezva pro koncentrace 25–250 pg/mL s R2 > 0,99 pro oba peptidy.
• Citlivost pro těžké peptidy do 10 amol s CV < 11 % a linearitou > 0,97 přes čtyři řády velikosti.
• Současná kvantifikace a potvrzení identity bez nutnosti optimalizace fragmentů díky HCD rozkladné energii.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zvýšení citlivosti a selektivity detekce rHuEPO bez dodatečné separace FAIMS.
• Prodloužení okna detekce rHuEPO v plazmě nad 48 hodin po aplikaci.
• Zjednodušení vývoje metody a odstranění potřeby předvýběru fragmentů u SRM.
• Možnost přesné kvantifikace pomocí stabilních izotopových standardů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Platforma se dá rozšířit na další proteinové a peptidové léky v antidopingové i farmaceutické oblasti:

• Automatizace imunoafinitních kroků pro vyšší průtok vzorků.
• Integrace iontové mobility a dalších separačních technik pro zlepšení selektivity.
• Vývoj pokročilých bioinformatických nástrojů pro automatizované vyhodnocení HCD spekter.
• Aplikace v personalizované medicíně a monitoringu biologických léčiv.

Závěr

Kombinace imunoafinitní extrakce s anti-EPO monolitickými sloupci a vysoce rozlišujícím nanoLC-Q Exactive MS/MS poskytuje citlivou a specifickou metodu pro detekci a kvantifikaci rHuEPO v koňském plazmatu na úrovni 25 pg/mL. Tento přístup překonává tradiční triple-kvadrupólové techniky, zkracuje čas vývoje a umožňuje souběžné potvrzení identity a kvantifikaci.

Reference

1. Bailly-Chouriberry L, Cormant F, Garcia P, Lönnberg M, Szwandt S, Bondesson U, Popot MA, Bonnaire Y. Analyst. 2012;137(10):2445–2453.
2. Guan F, Uboh C, Soma L, Birks E, Chen J, Mitchell J, You Y, Rudy J, Xu F, Li X, Mbuy M. Anal Chem. 2007;79(12):4627–4635.
3. Michalski A, Damoc E, Hauschild JP, Lange O, Wieghaus A, Makarov A, Nagaraj N, Cox J, Mann M, Horning S. Mol Cell Proteomics. 2011;10(9):M111.011015.