A biologist’s guide to modern techniques in quantitative proteomics

Význam tématu

Proteiny reagují na vnější i vnitřní podněty a zajišťují klíčové buněčné funkce. Kvantitativní proteomika nabízí měření změn v hladinách proteinů a jejich posttranslačních modifikací s vysokou citlivostí a přesností, což je zásadní pro pochopení biologických procesů a vývoj nových terapeutických přístupů.

Cíle a přehled studie / článku

Článek shrnuje moderní přístupy kvantitativní proteomiky, rozděluje je na objevné (discovery) a cílené (targeted) metody a poskytuje doporučení pro výběr vhodné strategie podle povahy vzorku, požadavků na přesnost a dostupnosti instrumentace.

Použitá metodika a instrumentace

• Kapalinová chromatografie (LC) spojená s hmotnostní spektrometrií (MS)
• Orbitrap a hybridní analyzátory pro vysoké rozlišení (HRAM)
• Triple quadrupole (TSQ) pro SRM a SIM režimy
• Metody značení: SILAC, TMT, isobarické značky
• Režimy akvizice dat: data-dependent acquisition (DDA) a data-independent acquisition (DIA)
• Cílené strategie: SRM, SIM, PRM a SureQuant s vnitřními standardy

Hlavní výsledky a diskuse

Objevné metody LFQ-DDA a LFQ-DIA umožňují porovnávat neomezený počet vzorků bez značení, avšak vyžadují vysoce reprodukovatelné chromatografické podmínky a sofistikované softwarové nástroje pro zpracování dat. SILAC přináší přesné vnitrobuněčné značení, TMT umožňuje multiplexovat až 16 vzorků v jedné analýze. Cílené přístupy na triple quadrupole (SRM, SIM) nabízejí vysokou citlivost pro desítky cílů, PRM na HRAM přístrojích umožňuje důvěryhodné potvrzení peptidů a SureQuant optimalizuje akvizici v reálném čase pomocí těžkých standardů pro stovky cílů.
Příklady aplikací:

• LFQ-DDA v analýze karcinomu prostaty (>6400 proteinů)
• LFQ-DIA v analýze močového proteomu u pediatrických diagnóz
• SILAC pro monitoring fosforylace při infekci HIV
• TMT v biomarkerovém screeningu plazmy u srdečního selhání (PH-HFpEF)
• SRM sledování trombospondinu a hemoglobinu při koagulaci
• SIM kvantifikace 86 kvasinkových peptidů
• PRM a SureQuant cílená analýza signální dráhy AKT/mTOR

Přínosy a praktické využití metody

Moderní kvantitativní proteomika umožňuje:

• Komplexní mapování proteomů a posttranslačních modifikací
• Návrh a validaci biomarkerů
• Vyhodnocení farmakologického zásahu a mechanismu účinku
• Relativní i absolutní kvantifikaci proteinů
• Snížení nákladů a času díky multiplexním přístupům (TMT, SILAC)
• Vysokou citlivost v malých a složitých vzorcích

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj:

• Integrace real-time databázového vyhledávání a strojového učení
• Zvýšení multiplexingu nad 16 kanálů a vyšší propustnosti
• Algoritmické zpracování chybějících hodnot v LFQ
• Hybridní workflow kombinující objevné a cílené přístupy
• Uplatnění v klinických studiích pro personalizovanou medicínu

Závěr

Výběr kvantitativní metody závisí na cílech studie, složitosti vzorku a dostupných zdrojích. Label-free přístupy jsou vhodné pro neomezený počet vzorků, multiplexní strategie (TMT, SILAC) pro rozsáhlé biomarkerové studie a cílené metody (SRM, PRM, SureQuant) pro vysokou citlivost a přesnost. Workflow SureQuant nabízí robustní a citlivé řešení pro rozsáhlé cílené analýzy.

Reference

1. Thompson A. et al. Anal Chem. 2003;75(8):1895-1904.
2. Ong S.E. et al. Mol Cell Proteomics. 2002;1(5):376-386.
3. Bantscheff M. et al. Anal Bioanal Chem. 2007;389(4):1017-1031.
4. Kiyonami R. et al. Thermo Scientific Application Note #500, 2010.
5. Dufresne C. et al. ASMS 2019 Poster.
6. Eliuk S. et al. ASMS 2013 Poster.
7. Hebert A.S. et al. Nature Methods. 2013;10:332-334.
8. Bomgarden R.D. et al. ASMS 2017 Poster.
9. McAlister G.C. et al. Anal Chem. 2014;86(14):7150-7158.
10. Erickson B.K. et al. J Proteome Res. 2019;18(3):1299-1306.
11. Snovida S.I. et al. ASMS 2019 Poster.
12. Peterson A.C. et al. Mol Cell Proteomics. 2012;11:1475-1488.
13. Gallien S. et al. ASMS 2019 Poster.
14. Sarracino D. et al. ASMS 2017 Poster.
15. Kiyonami R. et al. ASMS 2011 Poster.
16. Gallien S. et al. Hupo 2018 Poster.