Automated High-Throughput Oligo QC: From Automated Sample Preparation to MALDI Spectra Assessment

Význam tématu

Syntetické oligonukleotidy jsou klíčové nástroje v molekulární biologii a genetickém výzkumu. Kontrola jejich identity a čistoty je zásadní pro spolehlivé výsledky sekvenování a amplifikace DNA. MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie představuje rychlou, specifickou a vysoce propustnou metodu QC, kterou lze dále zvýšit automatizací procesů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem příspěvku je představit ucelený protokol plně automatizované přípravy primerů, jejich analýzu pomocí MALDI-TOF MS a následné automatizované vyhodnocení spekter v softwaru BioPharma Compass 2021. Protokol demonstruje vysokou efektivitu, reprodukovatelnost a rychlost QC oligonukleotidů.

Použitá metodika

Robotic pipetovací stanice Bravo byla použita pro přípravu DAC a 3-HPA/DAC matrix, nanesení 1 µl matrix roztoku a 1 µl vzorku na MTP AnchorChip 384. Vzorky se sušily 5–10 minut při pokojové teplotě. MALDI-TOF MS analýza probíhala v pozitivním lineárním módu při rozsahu 5–20 kDa na přístroji autoflex maX. Data se zpracovávala ve flexAnalysis s metodou pro malé proteiny a importovala do BioPharma Compass 2021. QC atributy zahrnovaly relativní intenzitu base peaku, hmotnostní přesnost a spektrální podobnost (cosine score).

Použitá instrumentace

• Bravo Automated Liquid Handling Platform (Agilent)
• autoflex maX MALDI-TOF MS (Bruker)
• BioPharma Compass 2021 a flexAnalysis (Bruker)
• MTP AnchorChip 384, 3-HPA, Diammonium citrate, acetonitril

Hlavní výsledky a diskuse

Šest univerzálních primerů (17–20 mer) bylo analyzováno v osmi replikátech. Spektra dosahovala požadovaných QC atributů, převážně označených zeleně. Plný workflow pro 384 vzorků vyžaduje ~50 minut automatického zpracování, což umožňuje kontrolu až 10 desek během osmihodinové směny. U oligonukleotidů >30 bp se doporučuje doplňková LC-ESI QTOF analýza kvůli nižší úspěšnosti MALDI QC.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný protokol přináší vysokou propustnost, minimalizuje chyby operátorů a zkracuje dobu potřebnou k získání výsledků. Uvolňuje kapacity vědců pro složitější úkoly a lze jej snadno adaptovat na různé délky a typy oligonukleotidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další zvýšení propustnosti je možné implementací 384kanálových pipetovacích hlav a plnou integrací sekundární LC-ESI QTOF analýzy pro vyšší molekulové hmotnosti. Podobný přístup lze aplikovat i na QC jiných biomolekul a peptidů.

Závěr

Předložený postup kombinuje plně automatizovanou přípravu vzorků, vysokorychlostní MALDI-TOF MS analýzu a automatické vyhodnocení dat v BioPharma Compass. Metoda poskytuje spolehlivou, rychlou a vysoce propustnou QC platformu pro syntetické oligonukleotidy a šetří čas operátorů pro hodnotnější úkoly.

Reference

1. Haslam C et al. (2016) The Evolution of MALDI-TOF Mass Spectrometry toward Ultra-High-Throughput Screening 1536-Well Format and Beyond J Biomol Screen 21(2):176-186
2. Ritorto MS et al. (2014) Screening of DUB activity and specificity by MALDI-TOF mass spectrometry Nat Commun 5:4763
3. Bruker Daltonik GmbH (2020) Tech Note Rapid Oligonucleotides QC with Automated High Resolution ESI-LCMS and BioPharma Compass 07-2020
4. Bruker Daltonik GmbH (2019) Flash Note The Complete Solution Oligonucleotide 03-2019