Rapid Analysis of Genotoxic Nitrosamines by HPLC-MS/MS

Význam tématu

Genotoxické nitrosaminy představují vysoce rizikové karcinogenní látky, které se mohou vyskytovat jako nečistoty v léčivých přípravcích. Díky své schopnosti poškozovat DNA i při velmi nízkých koncentracích je nutné je spolehlivě detekovat a kvantifikovat pod úrovní prahu toxikologické obavy (TTC, 1,5 µg/den). Vypracování rychlého, citlivého a opakovatelného analytického postupu je klíčové pro zajištění bezpečnosti léčiv a vyhovění regulatorním požadavkům FDA a EMA.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout šestiminutovou HPLC-MS/MS metodu pro simultánní stanovení osmi prvotních nitrosaminů v konečných farmaceutických formulacích. Metoda měla dosáhnout dolní hranice kvantifikace (LLOQ) ekvivalentní 0,05 µg/g v produktu, což výrazně podléhá hranici toxikologické obavy.

Použitá instrumentace

• Kapalinový chromatograf ExionLC (SCIEX)
• Triple Quad 4500 (SCIEX) s APCI ionizací v pozitivním režimu MRM
• HPLC kolona Phenomenex Kinetex F5, 2,5 µm, 50 × 2,1 mm
• Ultrazvuková lázeň a vortex mixer pro přípravu vzorků

Použitá metodika

Vzorky z kapslí (např. valsartanu 80 mg) byly extrahovány v MeOH–voda (1:1) při koncentraci 2 mg/mL. Po vortexu, sonikaci a odstředění se sérum odebralo do HPLC vialek. Kalibrační křivky pro osm analyzovaných nitrosaminů byly připraveny v rozsahu 0,1–20 ng/mL. Chromatografické rozdělení zajišťoval gradient z 85 % vodné fáze s 0,1 % kyseliny mravenčí na 95 % methanolu při průtoku 0,5 mL/min a teplotě 40 °C. Mass spectrometr pracoval na APCI režimu s MRM přechody definovanými pro každý analyzát.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vysokou specificitu bez interferencí ve slepých vzorcích. Dynamický rozsah je lineární (r>0,998) v celém rozsahu 0,1–20 ng/mL. LLOQ 0,1 ng/mL (ekvivalent 0,05 µg/g) je výrazně pod limitem TTC. Obnova QC vzorků (0,5, 5,0 a 15,0 ng/mL) se pohybovala mezi 89,5 % a 112,0 %, s mezibodovou variabilitou (%RSD) 0,61–4,42 %. Reprodukovatelnost na LLOQ úrovni vykázala %RSD 1,53–2,48 %. Analýza reálného sultanu ukázala přítomnost NDMA 0,2 ng/mL (0,1 µg/g), což je pod hranicí toxikologické obavy.

Přínosy a praktické využití metody

Vneste-li tuto metodu do rutinní kontroly kvality a vývoje léčiv, laboratorní provozy získají rychlý a robustní nástroj pro detekci genotoxických nitrosaminů. Díky krátké analýze (6,5 min) a snadné přípravě vzorků je metoda vhodná pro vysokoprostorové screeningy i regulované farmaceutické testování.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření spektra sledovaných nitrosaminů a aplikace ultrarychlých LC systémů pro ještě kratší doby analýzy. Využití výkonnějších hmotnostních analyzátorů a zdokonalení ionizačních technik (např. APCI vs. ESI) by mohlo dále zlepšit citlivost a selektivitu. Integrace do automatizovaných platform pro online extrakci a analýzu poskytne plně integrovaná řešení pro farmaceutický průmysl.

Závěr

Popsaná LC-MS/MS metoda na bázi SCIEX Triple Quad 4500 a ExionLC splňuje přísné požadavky na citlivost i rychlost detekce genotoxických nitrosaminů v farmaceutických přípravcích. LLOQ 0,05 µg/g a vynikající přesnost, preciznost a linearita prokázaly praktickou využitelnost metody pro QA/QC i vývojové laboratoře.

Reference

• Guo Lihai, Long Zhimin, Leng Xiangyang (2019) Rapid Analysis of Genotoxic Nitrosamines by HPLC-MS/MS. SCIEX App. Note RUO-MKT-02-9127-A.
• US FDA, EMA Guidelines on Genotoxic Impurities, 2018.