Quantitative Analysis of Nitrosamine Impurities in Synthetic Oligonucleotides

Význam tématu

Nitrosaminy patří mezi vysoce genotoxické a karcinogenní nečistoty, jejichž přítomnost v léčivých přípravcích podléhá přísným regulačním požadavkům. S nástupem syntetických oligonukleotidových terapií je nezbytné zajistit kontrolu těchto látek i v nových léčebných molekulách, aby byla zaručena bezpečnost pacientů a shoda s mezinárodními standardy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout citlivou a reprodukovatelnou LC–MS/MS metodu pro kvantifikaci osmi vybraných nitrosaminů v antisense oligonukleotidech (ASO) na úrovni ppt. Použit byl Agilent 6495D triple quadrupole systém v kombinaci s Agilent 1290 Infinity II bio LC.

Použitá metodika

Vzorkem byl 21mer fosforothioátový ASO (1 mg/mL) v 10 % methanol/voda. Nitrosaminové standardy byly přidány v koncentracích 0,05–25 ng/mL. Pro kontrolu kvality byly připraveny QC vzorky při 0,2 ng/mL (LQC), 2 ng/mL (MQC) a 20 ng/mL (HQC). Vzorky byly aplikovány triplikátně (kalibrace) a duplikátně (QC). Chromatografie probíhala na C18 kolonu s gradientem formamidu v H2O a methanolu.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II bio LC system (pumpa, autosampler, multikolonový termostat)
• Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18, 3,0×150 mm, 2,7 µm
• Agilent 6495D triple quadrupole LC/TQ s APCI zdrojem
• Agilent MassHunter Acquisition (v 12.2) a Quantitative Analysis (v 12.1)

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla vynikající chromatografické separace a lineárních kalibrací s R2 > 0,99 (výjimka NPIP R2 = 0,996), LOD 0,01–0,1 ng/mL a LOQ 0,05–0,25 ng/mL. Přesnost (accuracy) se pohybovala mezi 90–120 %, intradenní opakovatelnost pod 4 % RSD a mezidení reprodukovatelnost pod 8 %. Obnovení (recovery) bylo 90–101 %. U NPIP byla identifikována matrice interference, kterou lze eliminovat použitím divert ventilu.

Přínosy a praktické využití metody

Prokázaná vysoká citlivost a robustnost umožňují rutinní sledování nitrosaminových nečistot v oligonukleotidových API. Metoda podporuje splnění FDA, EMA a ICH M7 požadavků a zajišťuje kvalitu a bezpečnost nových terapie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metodiky na další genotoxické nečistoty, integrace automatizace přípravy vzorků a multiplexní analýzy. Další možnosti představují monolitické nanoLC kolony a kombinace s HRMS pro ještě vyšší citlivost a specifitu v různých maticích.

Závěr

Vyvinutá LC–MS/MS metoda na platformě Agilent 6495D LC/TQ prokázala vysokou citlivost, linearitu, přesnost i opakovatelnost pro analýzu osmi nitrosaminů v ASO. Je vhodná pro rutinní QA/QC kontrolu a splňuje přísné regulatorní standardy.

Reference

• Borths C. J.; Burr T.; Figuccia A.; Ford J. G.; Guan B.; Jones M. T.; Klingeleers D.; Lochner S.; Rodriguez A. A.; Wetter C. Nitrosamine Risk Assessments in Oligonucleotides. Org. Process Res. Dev. 2023, 27, 1693–1702.
• Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs: Guidance for Industry (Revision 2). U.S. FDA, 2024.
• Nitrosamine Impurities: Guidance for Marketing Authorisation Holders. EMA, 2025.
• Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk: ICH M7(R2), ICH, 2023.