Sensitive AAV Capsid Protein Impurity Analysis by CE Using Easy to Label Fluorescent Chromeo Dye P503

Význam tématu

Adeno asociovaný virus (AAV) je klíčový vektor genové terapie díky vysoké stabilitě a nepatogenitě. Přesná kvantifikace nečistot kapsidových proteinů je zásadní pro zajištění bezpečnosti a účinnosti terapeutických přípravků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout citlivou a rychlou metodu pro stanovení kapsidových proteinových nečistot AAV8 pomocí kapilární elektroforézy s laserem indukovanou fluorescencí (CE‐LIF) a jednoduchým značením fluorescentní barvou Chromeo P503.

Použitá instrumentace

• PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System se LIF detektorem (excitační 488 nm, emisní filtr 600 nm)
• CE‐SDS MW kit (SCIEX PN 390953)
• 32 Karat software V10 pro akvizici a analýzu dat

Použitá metodika

Vzorek AAV8 byl připraven dvěfázovým postupem bez nutnosti výměny pufru či čištění volného barviva:

• Denaturace: 5 µl AAV (10¹¹ GC/ml), 5 µl CE‐SDS pufru, 1 µl DTT, 60 °C 10 min
• Značení: přidání 0,5 µl Chromeo P503 (1 mg/ml), 60 °C 20 min, následné naředění vodou na konečné koncentrace 1,1×10¹⁰ a 1,1×10⁹ GC/ml

Elektrokinetická injekce se stacking plugem vody (20 psi/0,6 min), separace CE‐SDS gelovou matricí.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje mez detekce 1,1×10⁹ GC/ml s poměrem signál/šum ≥ 3 pro VP3, VP2 a VP1. Porovnání detekce LIF versus UV ukazuje výrazně lepší citlivost a nižší LOQ. Pufr s nižším obsahem solí a pH 8 zlepšuje elektrokinetickou injekci a efekt značení. Vysoký poměr barvivo/protein vede k mírnému tailingu, který lze snížit výměnou pufru a koncentrací vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá příprava vzorku bez složité výměny pufrů
• Citlivá detekce kapsidových proteinů v terapeutických koncentracích
• Kompatibilita s existujícími CE‐SDS platformami

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace přípravy vzorků a zvýšení objemu značení
• Optimalizace poměru barvivo/protein pro eliminaci tailingu
• Rozšíření metody na další serotypy AAV
• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro komplexní charakterizaci

Závěr

CE‐SDS s LIF detekcí a Chromeo P503 poskytuje citlivou, opakovatelnou a snadno realizovatelnou metodu pro analýzu nečistot AAV8 kapsidových proteinů s LOQ 1,1×10⁹ GC/ml.

Reference

1. Agbandjie-McKenna M. et al., Molecular Therapy Methods & Clinical Development, 6, 171–182 (2017)
2. Bothner B. et al., Journal of Virology, 87(24), 13150–13160 (2013)
3. Active Motif, Chromeo P503 product insert
4. SCIEX Technical Note RUO-MKT-02-10086-A
5. Wright J. Fraser, Biomedicines, 2, 80–97 (2014)