Genome Sizing Methodology for Genome Integrity Analysis of Adeno-Associated Viruses (AAV)

Význam tématu

Adeno-asociovaný virus (AAV) se uplatňuje jako vektor genové terapie díky nízké imunogenicitě a efektivnímu přenosu genetického materiálu do různých tkání. Přesné stanovení integrity a velikosti genomu rAAV je klíčové pro účinnost a bezpečnost klinických i preklinických studií. Tradiční metody (denaturační agarózová elektroforéza, Southern blot) jsou časově náročné a mají omezené rozlišení.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a verifikovat nové metody pro analýzu velikosti a čistoty genomu AAV pomocí kapilární elektroforézy s fluorescenční detekcí (CE-LIF). Metody měly umožnit rychlou diferenciaci mezi kompletními genomy, zkrácenými sekvencemi a nízkomolekulárními nečistotami v produktech rAAV.

Použitá metodika a instrumentace

• Metoda CE-LIF na systému PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System (SCIEX) s Excitační vlnovou délkou 488 nm a emisním filtrem 520 nm
• Předsestavená EZ-CE kapilára
• Separace v gelové pufru obsahující 4 M močovinu, 1 % PVP, 1× TBE a barvivo SYBR Green II
• Pro úpravu vzorků: benzonáza pro degradaci vnějších nukleových kyselin, Amicon ultrafiltrační jednotka (100 kDa), proteináza K a QIAquick PCR purification Kit

Hlavní výsledky a diskuse

• Vysoké rozlišení CE-LIF umožnilo oddělit intaktní AAV genom (2,35–4,5 kb), částečné genomy (~1,3 kb) a malé nečistoty (0,5–1 kb) během 15 minut
• Benzonázová úprava a filtrace významně snížily množství vnějších nízkomolekulárních nečistot
• Standardní workflow trvá ~3 hodiny, oproti tomu zjednodušený screening za ~30 minut při zachování klíčového rozlišení
• Opakovatelnost separace pro migraci časových signálů lepší než 0,5 % (CV)
• Možnost kvantifikace titru na základě plochy intaktního genomu při další optimalizaci

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a přesné stanovení integrity genomu rAAV pro QC během výroby
• Omezení používání toxických činidel (formaldehyd, glyoxal) a snížení odpadu ve srovnání s agarózovou elektroforézou
• Univerzální aplikace na různé AAV serotypy
• Dva režimy práce: screeningový (rychlý přehled) a komplexní (hloubková analýza)

Budoucí trendy a možnosti využití

CE-LIF analýza genomové integrity AAV lze dále rozšířit o plně automatizované QC postupy a vestavěné stanovení titru. Dalšími směry jsou validace na dalších virových vektorech a vývoj interních standardů pro přesnější relativní kvantifikaci.

Závěr

Vyvinuté CE-LIF metody poskytují spolehlivou platformu pro rychlou detekci intaktních a částečných genomů AAV i nízkomolekulárních nečistot. Zjednodušený workflow vhodný pro in-process kontrolu šetří čas, zatímco komplexní režim nabízí detailní vhled do kvality výrobku.

Reference

• BioDrugs 31:317–334 (2017). Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy.
• Molecular Therapy 18(1):87–92 (2010). Characterization of Genome Integrity for Oversized Recombinant AAV Vector.
• Analytical Chemistry 83(13):5431–5435 (2011). Viral Quantitative Capillary Electrophoresis for Counting Intact Viruses.
• SCIEX Technical Notes RUO-MKT-02-8017-B (2018). Method Optimization and Evaluation for RNA Purity Analysis Using CE-LIF Technology.