Purity Analysis of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Proteins using CE-LIF Technology

Význam tématu

Adeno-asociovaný virus (AAV) je klíčovým vektorem pro genovou terapii. Pro zajištění bezpečnosti a účinnosti terapeutických přípravků je nezbytné přesné stanovení čistoty virových kapsidových proteinů, zvláště při nízkých koncentracích v in-procesních vzorcích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat vysoce citlivou metodu CE-SDS s fluorescenční detekcí (LIF) využívající FQ (furoyl-chinolin) značení, která umožní kvantifikaci AAV kapsidových proteinů (VP1, VP2, VP3) při koncentracích od 1×10¹⁰ GC/mL.

Použitá metodika

Pro štěpení a značení AAV kapsid bylo aplikováno následující schéma:

• Redukce a denaturace proteinů v SDS/NEM roztoku při 70 °C.
• Fluorescenční značení FQ barvivem za přítomnosti KCN při 70 °C.
• Quenchování reakce SDS, doplnění objemu vodou a volitelná výměna pufru k odstranění nadbytku solí.
• Elektrokinetická injekce vzorku se stackingem water-plug pro zvýšení citlivosti.
• Separace na kapilární elektroforéze s detekcí laser-indukovanou fluorescencí (488 nm excitace, 600 nm emise).

Použitá instrumentace

• PA800 Plus Biologics Analysis CE systém (SCIEX).
• LIF detektor se 488 nm pevnolátkovým laserem a 600 nm filtrem.
• EZ-CE kapilární kazeta (50 µm I.D., 30 cm délka, 20 cm efektivní délka).
• SDS-MW Analysis Kit včetně gelového pufru a wash-roztoků.
• Software 32 Karat™ pro akvizici a zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• Citlivost metody umožňuje spolehlivou detekci kapsidových proteinů až při 1×10¹⁰ GC/mL, což je výrazné zlepšení oproti konvenční PDA detekci (min. 1×10¹² GC/mL).
• Vysoké rozlišení VP1, VP2 a VP3 s čistou základní linií.
• Opakovatelnost: RSD migrace <0,5 % a RSD korigované plošné plochy <5 % (1×10¹²–1×10¹³ GC/mL) a <10 % při 1×10¹⁰ GC/mL.
• Lineární závislost signálu na koncentraci v rozsahu 1×10¹⁰ až 1,6×10¹⁴ GC/mL s R²=0,9989 (analýza VP3).

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizovaná kapilární elektroforéza se snižuje čas a pracovní náročnost ve srovnání se SDS-PAGE.
• Možnost in-procesního monitoringu AAV přípravků v reálném čase při nízkých titrech.
• Vhodnost pro QA/QC procesy v GMP prostředí a vývoj nových vektorů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další sérotypy AAV a jiné virové vektory.
• Integrace s hromadnou spektrometrií pro detailní charakterizaci post-translačních modifikací.
• Miniaturizace a microfluidické platformy pro vysokoprůtokové screeningy.
• Adaptace pro multiplexní kvantifikaci více parametrů v jednom běhu.

Závěr

CE-SDS-LIF metoda s FQ značením představuje robustní, vysoce citlivý a reprodukovatelný přístup k analýze čistoty AAV kapsidových proteinů, který splňuje požadavky in-procesní kontroly při velmi nízkých titrech a nabízí široké uplatnění v oblasti genové terapie.

Reference

• 1. Stanford GVVC AAV Overview.
• 2. SCIEX Technical Note: Purity Analysis of AAV Capsid Proteins using CE-SDS.
• 3. Zhang C., Meagher M. M. Anal. Chem. 2017, 89, 3285–3292.
• 4. Quirino J. Modern Injection Modes (Stacking) for CE. 2015.
• 5. SCIEX Technical Note: Using Fluorescent Labels to Increase Sensitivity of IgG Purity Assay on PA 800 plus.