Characterization of 2-AB Labeled Released N-linked Glycans Using SCIEX TripleTOF® 5600+ LC-MS/MS System

Význam tématu

N-glykany na monoklonálních protilátkách hrají klíčovou roli v biologických a fyzikálně-chemických procesech, včetně stability proteinu, odolnosti proti proteázám, prodlouženého sérového poločasu a efektivity závislé na protilátkách.

Cíle a přehled studie / článku

Tato studie předvádí charakterizaci 2-AB značených uvolněných N-glykanů z mAb pomocí systému SCIEX TripleTOF 5600+ LC-MS/MS. Porovnává se účinnost HILIC separace na dvou typech kolonek a ukazuje se využitelnost softwarů MasterView a SCIEX OS pro cílenou analýzu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly připraveny denaturací a redukcí (RapiGest, DTT), uvolněny enzymem PNGase F, označeny 2-AB reagencí a čištěny kartridžemi. Chromatografie probíhala na Dionex Ultimate 3000 s mobile phase A (100 mM amonium formiát pH 4) a B (acetonitril) na kolonkách Waters BEH amide (1,7 µm) a Phenomenex Biozen (2,6 µm), teplota 40 °C, detekce fluorescence (330/420 nm). Mass spectrometry: SCIEX TripleTOF 5600+ s DuoSpray, režim ESI+, IDA, TOF MS 250–2500 m/z, MS/MS 100–3000 m/z. Analýza dat v MasterView 1.1, SCIEX OS 1.6.1 a GlycoWorkbench.

Hlavní výsledky a diskuse

• Obě kolony účinně oddělily glykany podle počtu sialových kyselin.
• Phenomenex Biozen nabídl odlišné chromatografické profily bez ztráty citlivosti u sialylovaných forem.
• Bylo identifikováno 12 N-glykanů s hmotnostní odchylkou do 5 ppm a potvrzenou strukturou díky MS/MS fragmentaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Kombinace fluorescence a MS/MS zajišťuje jednoznačné přiřazení glykantových struktur.
• Režim IDA a cílená extrakce zrychlují průchod daty ve zvolených softwarových nástrojích.
• Metoda je vhodná pro komplexní glykonomické studie biolékových molekul.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj povede k automatizaci přípravy glykanů, zvyšování propustnosti LC-MS analýz, integraci strojového učení pro interpretaci MS dat a rozšíření aplikací v personalizované medicíně, QA/QC biotechnologických přípravků a glykoproteomických výzkumech.

Závěr

Prezentovaná LC-MS/MS metoda poskytuje robustní, citlivou a spolehlivou charakterizaci 2-AB značených N-glykanů z mAb, kombinuje efektivní chromatografii s informačně závislou MS/MS akvizicí a pokročilou softwarovou analýzou pro přesné stanovení struktur.

Reference

1. Characterization of 2-AB Labelled Released N-linked Glycans Using the X500B QTOF System. SCIEX Technical Note RUO-MKT-02-9202-A.