Characterization of 2-AB Labelled Released N-linked Glycans Using the X500B QTOF System

Význam tématu

Glykanové modifikace bioterapeutik významně ovlivňují jejich farmakologické vlastnosti, včetně afinity, stability, imunogenicity a účinnosti. Přesná charakterizace N-vázaných glykanů je proto klíčová v průběhu vývoje a komercializace biopharmaceuticals.

Cíle a přehled studie

Tato studie demonstruje aplikaci systémů HILIC spojeného s fluorescenční detekcí a vysokorozlišovacím QTOF MS (SCIEX X500B) pro analýzu 2-AB značených N-vázaných glykanů u humanizovaného IgG. Hlavním cílem bylo dosáhnout jednoznačné identifikace a relativní kvantifikace glykanské struktury.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky humanizovaného IgG byly enzymaticky ošetřeny PNGase F pro uvolnění N-glykanů, následně značené 2-AB dle komerčního protokolu. Chromatografická separace proběhla na HILIC kolonce BEH amide za použití dvou mobilních fází (0,05 % TFA vs 50 mM ammonium formiát pH 4,2) dle stanovených gradientních podmínek. Injectován byl roztok 30 µl vzorku smíchaného s acetonitrilem. MS měření probíhalo v IDA režimu při pozitivním módu s masovým rozsahem m/z 200–1800 a CE dle kovariančního modelu. Data byly zpracovány v softwaru SCIEX OS 1.5.0.23389.

Použitá instrumentace

• QTOF MS SCIEX X500B se zdrojem Turbo V™ a TwinSpray sondou
• Shimadzu Nexera LC systém
• Waters BEH Amide kolona (130 Å, 1,7 µm, 2,1 × 100 mm)
• Shimadzu RF-20xs fluorescence detektor
• Prozyme PNGase F a 2-AB labeling kit
• Software SCIEX OS 1.5.0.23389 pro acquisici a analýzu dat

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo identifikováno 27 N-vázaných glykanů s přesností mass error ≤ 5 ppm. Separace s TFA vs formiátovými pufry vykázala srovnatelnou selektivitu, avšak TFA podmínky nabídly vyšší citlivost pro sialylované formy. MS/MS fragmentace potvrdila klíčové strukturální rysy, včetně core-fukosylace (příklad G0F) a bi-antenární struktury se sialylací (FA2G2S1). Integrace fluorescenčního signálu v prostředí SCIEX OS Analytics umožnila rychlou relativní kvantifikaci složek glykoprofilu.

Přínosy a praktické využití metody

• Kombinace HILIC-FLR-MS zajišťuje vysokou specifitu a citlivost glykanové analýzy.
• Integrované workflow v SCIEX OS usnadňuje validaci a compliance.
• MS/MS fragmentace doplňuje informace z retenčních časů a GU pro jednoznačné přidělení struktur.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj nových fluorescenčních a MS-aktivních štítků (např. RapiFluor-MS) může dále zvýšit citlivost a throughput. Rozšíření metodik pro další posttranslační úpravy, automatizace preanalytických kroků a pokročilá softwarová řešení umožní širší nasazení v průmyslové glykomice.

Závěr

Systém SCIEX X500B QTOF v kombinaci s HILIC-FLR představuje robustní a vysoce specifické řešení pro komplexní charakterizaci N-vázaných glykanů biotherapeutik. Integrovaný software podporuje celistvé workflow od acquisice po kvantifikaci a strukturální potvrzení.

Reference

Zhang Z, McCarthy S. Characterization of 2-AB Labelled Released N-linked Glycans Using the X500B QTOF System. SCIEX Technical Note RUO-MKT-02-9202-A; 2019.