A New Level of Compliant-Ready Intact Biotherapeutic Protein Quantification using Reconstructed Masses

Význam tématu

V oblasti bioanalytiky bioterapeutik roste poptávka po metodách poskytujících přesnou, flexibilní a rychlou kvantifikaci velkých proteinů, zejména monoklonálních protilátek. Metoda založená na rekonstrukci hmotností nabízí alternativu k tradičnímu bottom-up přístupu, minimalizuje riziko vzniku artefaktů při přípravě vzorku a snižuje vliv matrice na výslednou kvantifikaci.

Cíle a přehled studie

Studie představuje implementaci intact protein kvantifikace pomocí SCIEX OS Software 1.7 s rekonstrukcí hmotností a demonstruje:

• možnosti kvantifikace monoklonálních protilátek v potkaní plazmě,
• srovnání přístupu založeného na XIC vs. rekonstrukci hmotností,
• dodržení regulačních požadavků 21 CFR Part 11 a GLP.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation: selektivní obohacení lidské IgG pomocí biotinylovaných proti-Fc protilátek a magnetických částic.
Chromatografie: reverzní fázová kolona PLRP-S (2.1×50 mm, 5 µm, 300 Å), mobilní fáze voda/ACN s 0,1 % FA, gradient 75–90 % B, 500 µL/min, 80 °C.
Mass spectrometry: ExionLC™ spojené se SCIEX X500B QTOF nebo TripleTOF® 6600, režim TOF-MS positive, 2 000–4 000 m/z, 0,5 s accumulace, 250 V deklusterace.
Data processing: SCIEX OS Software 1.7 s modulem pro rekonstrukci hmotností, MQ4 algoritmus, parametry: 147–150 kDa, rozlišení 3 000, 20 iterací.

Hlavní výsledky a diskuse

Rekonstrukce hmotností umožnila sumaci signálu napříč celým spektrem nábojových stavů a glykoformami, což vedlo k hladké kalibraci v rozsahu 0,1–100 µg/mL s lineárním rozsahem tří dekád a koeficientem R2 > 0,99. Metoda vykázala přesnosti 95–107 % a chemickou selektivitu nad standardním XIC kvantifikací, zejména při složitějších matricích.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší citlivost a přesnost kvantifikace intact proteinů oproti jednotlivým XIC,
• Redukce času na vývoj metody díky jednoduché integraci peaků z rekonstruovaného spektra,
• Minimalizace vlivu matricových interferencí,
• Regulační připravenost (21 CFR Part 11, GLP).

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda se dá rozšířit na analýzu subjednotek proteinů nebo deglykozylovaných forem, čímž lze dále zvýšit citlivost. Dále je perspektivní integrace s vysokopropustným screeningem a automatizovanými platformami pro farmaceutický vývoj.

Závěr

Rekonstrukce hmotností v SCIEX OS 1.7 představuje spolehlivou, flexibilní a regulačně připravenou platformu pro intact protein kvantifikaci. Umožňuje rychle dosáhnout přesných výsledků i ve složitých matricích a nabízí další prostor pro rozšíření do dalších tříd proteinových analytů.

Reference

• Jian W., Kang L., Burton L., Weng N.: A workflow for absolute quantitation of large therapeutic proteins in biological samples at intact level using LC-HRMS. Bioanalysis 8, 1679–1691 (2016).
• White Paper, SCIEX OS LC/MS Software and 21 CFR Part 11 Regulations. RUO-MKT-19-10018.