Analysis of Intact Monoclonal Antibodies Using an M3 MicroLC with the TripleTOF® 6600

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAbs) představují klíčovou třídu bioterapeutik využívaných v léčbě onkologických, autoimunitních a dalších onemocnění. Detailní přehled primární struktury, heterogenity a posttranslačních modifikací ovlivňuje účinnost, stabilitu i bezpečnost léčivého přípravku. Analytické metody založené na LC-MS jsou nezbytné pro komplexní charakterizaci a kvantifikaci intact mAbs.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje robustní a citlivý workflow pro simultánní kvalitativní i kvantitativní analýzu intact monoklonálních protilátek pomocí M3 MicroLC ve spojení s vysokorozlišovacím TOF spektrometrem TripleTOF 6600. Hlavním cílem bylo ověřit přesnost, citlivost a linearitu metody při rozsahu 0,1–100 ng na kolonu a porovnat on-column desalting s tradičními off-line postupy.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow je založeno na on-column desaltingu přímo na M3 MicroLC (SCIEX) s kolonkou Waters ACQUITY UPLC M-Class Protein BEH C4 (300 Å, 1,7 µm, 300 µm × 50 mm), průtok 15 µl/min, 10min gradient (3 min desalting, 7 min separace 20–80 % acetonitrilu). Mobilní fáze obsahuje 0,1 % kyseliny mravenčí a 0,01 % TFA. Mass spektrometr TripleTOF 6600 s DuoSpray™ zdrojem, 25 µm I.D. elektroda, pozitivní ionizace, rozsah m/z 1000–5000, režim intact protein, ISVF 0 V při desaltingu, 5500 V při analýze. Data byly zpracovány v BioPharmaView™ pro dekonvoluci a identifikaci PTM a v MultiQuant™ pro kvantitaci.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla limity detekce i kvantifikace na úrovni 0,1 ng intact mAb s lineárním dynamickým rozsahem 3 řády (0,1–100 ng). Dosahuje vysoké reprodukovatelnosti retenčních časů (STDEV ≤ 0,01 min), spekter i integračních ploch. On-column desalting zkrátil čas přípravy vzorku (~30 min) a snížil ztráty oproti off-line membránovým filtrům. Workflow umožnilo detekci a kvantifikaci třech IgG1 modelových protilátek (standard, adalimumab, trastuzumab) i charakterizaci hlavních glykoforem při dávkách od 2,5 ng. Linearita kalibračních křivek vykazovala korelační koeficienty ≥ 0,99.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená citlivost a nízká spotřeba vzorku umožňují analýzy vzácných či drahých antikorových přípravků.
• Vyšší propustnost (~140 vzorků/den) díky eliminaci off-line desaltingu a zkrácenému běhu LC.
• Snížené náklady na reagencie, enzymy a provoz díky minimalizaci kroků přípravy.
• Komplexní charakterizace intact mAbs včetně PTM a glykosilací podporuje vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rostoucí zájem o proteinová bioterapeutika povede k širšímu nasazení microflow LC-MS platforem. Integrace s MS/MS a MRM metodikami umožní hlubší profilování glykosylací a jiných modifikací. Potenciál mají rovněž antibody–drug conjugates (ADC) a multispektrální analýzy using multiplexované nano-LC systémy.

Závěr

Popisovaný workflow M3 MicroLC – TripleTOF 6600 je robustní, citlivá a vysoce reprodukovatelná metoda pro simultánní kvantitativní i kvalitativní analýzu intact monoklonálních protilátek. On-column desalting výrazně zefektivňuje přípravu vzorku a minimalizuje ztráty, což umožňuje detailní charakterizaci PTM a glykoforem při velmi nízkých dávkách.

Reference

• Johansen E., Shin B.-H., Hunter C. Simultaneous Quantitative and Qualitative Analysis of Proteolytic Digests of Therapeutic Monoclonal Antibodies Using a TripleTOF® System. SCIEX Technical Note 7460213-01 (2018).
• Johansen E., Albanese J., Hunter C. Analysis of Intact and Reduced Therapeutic Monoclonal Antibodies using the TripleTOF™ 5600 System. SCIEX Technical Note 4220211-01 (2018).
• Wagner H. M. Linear Programming Techniques for Regression Analysis. American Statistical Association Journal, 1959, p. 207–212.
• Albanese J., Hunter C. L., Meitei N. S. Profiling the Distribution of N-Glycosylation in Therapeutic Antibodies using the QTRAP® 6500 System. SCIEX Technical Note RUO-MKT-02-2590-A (2018).