High Throughput Abundant Protein Depletion for Plasma Proteomics

Význam tématu

Analýza proteinů v biologických tekutinách, jako je plazma, je základem pro objevování biomarkerů nemocí. Široké dynamické rozpětí koncentrace proteinů ve vzorku (>10 řádů) a vysoký podíl nejhojnějších proteinů (albumin a imunoglobuliny) významně omezuje detekci nízce zastoupených proteinů, které mohou nést diagnostické či prognostické informace.

Cíle a přehled studie / článku

Účelem studie bylo vyvinout a validovat vysoce výkonnou formu živné látky pro depleci nejhojnějších proteinů z lidské plazmy a dalších biofluid v 96jamkové filtrační destičce. Hlavními cíli byly:

• Optimalizace protokolu pro hromadnou úpravu až 96 vzorků současně.
• Srovnání účinnosti a reprodukovatelnosti s tradičním spin column formátem.
• Hodnocení rozšíření metody na jiné biologické tekutiny (CSF, sérum).
• Demonstrace přínosu pro identifikaci nízce zastoupených proteinů a biomarkerů onkologických onemocnění.

Použitá metodika

Vzorky (plazma, sérum, CSF) prošly následujícím postupem:

• Deplece nejhojnějších proteinů pomocí protilátkami modifikované Top14 živné látky v 96jamkové destičce nebo spin column formátu.
• Enzymatická proteolýza pomocí sady EasyPep 96 Sample Prep Kit.
• Peptidové koncentrace stanoveny kolorimetrickou či fluorimetrickou metodou Pierce Quantitative Peptide Assay.
• LC-MS analýza: gradientní eluce na Vanquish Neo UPLC se sloupcem C18 (50 cm) a rychlostí 300 nL/min.
• Data získána na masových spektrometrech Orbitrap Eclipse Tribrid, Orbitrap Exploris 480 a Orbitrap Astral.
• Label-free kvantifikace s přístupem data-independent acquisition (DIA).
• Datové zpracování v Proteome Discoverer 3.0 se SEQUEST HT a v 3.1 s algoritmem CHIMERYS, filtrace výsledků na 1 % FDR.

Použitá instrumentace

• Vanquish Neo UPLC system
• C18 Thermo Scientific EASY-Spray PepMap Neo column (50 cm)
• Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer
• Orbitrap Exploris 480 Mass Spectrometer
• Orbitrap Astral Mass Spectrometer
• Proteome Discoverer 3.0 / 3.1 se SEQUEST HT a CHIMERYS
• Pierce Quantitative Peptide Assay

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda deplece v 96-jamkové destičce dosahuje eliminace 90–95 % nejhojnějších proteinů s koeficientem variační odchylky pod 5 %. Srovnatelné výsledky s tradičním spin column formátem:

• Průměrný počet identifikovaných proteinů: 1216 (destička) vs. 1122 (column) vs. 507 (neúpravný vzorek).
• Průměrný počet identifikovaných peptidů: 12033 (destička) vs. 10471 (column) vs. 4793 (neúpravný vzorek).
• Stejná účinnost pro CSF a sérum při zlepšení počtu ID proteinů o 37–39 % oproti neúpravě.
• Label-free kvantifikace ukázala reprodukovatelné CV <10 % a jasné oddělení normálních a onkologických vzorků.
• Detekce možných biomarkerů: zvýšené hladiny Mucin 5B (3×), Cadherin-5 (2×) a CD44 (1,5×) v plazmě pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic.

Přínosy a praktické využití metody

Implementace 96-jamkové depleční destičky zkracuje dobu přípravy až na 7–8 hodin pro 96 vzorků při minimalizaci pracovních kroků. Metoda poskytuje vysokou propustnost, vynikající reprodukovatelnost a hlubší průzkum proteomu ve srovnání s konvenčními protokoly. Vhodné pro studia biomarkerů, QA/QC i průmyslovou analytiku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření do plně automatizovaných high-throughput platforem, kombinace s cílenými enrichmnty (např. PTM, afinitní zachytávání), integrace s pokročilou datovou analýzou poháněnou umělou inteligencí a validace větších klinických kohort pro robustní kvantifikaci biomarkerů.

Závěr

Vyvinutá 96-jamková depleční platforma pro Top14 proteiny významně zjednodušuje a urychluje přípravu vzorků pro proteomickou analýzu plazmy a dalších biofluid. Umožňuje hlubší pokrytí proteomu, vysokou reprodukovatelnost a efektivní detekci nízkomolekulárních proteinů, což přispívá k pokroku v objevování biomarkerů a aplikacím v klinickém výzkumu.

Reference

V textu nebyly uvedeny explicitní bibliografické citace.