Sampling the human population – ultra-high- throughput plasma protein profiling (uHTPPP) sample preparation for translational proteomics
Aplikace | 2020 | Thermo Fisher ScientificInstrumentace
Large-scale plasma proteomika vyžaduje spolehlivou, reprodukovatelnou a rychlou přípravu vzorků. Manuální postupy jsou časově náročné a mohou přidávat chybovost, což omezuje proveditelnost studií zahrnujících stovky až tisíce vzorků.
Cílem práce je představit ultra vysokokapacitní workflow uHTPPP pro přípravu krevní plazmy a séra na platformě Hamilton Microlab STARLet s minimem manuálních zásahů a vysokou přesností, optimalizované pro translational proteomics velkých lidských populací.
Workflow je založen na komerčním Thermo Scientific EasyPep 96 MS Sample Prep Kit a Hamilton Microlab STARLet s modulárními jednotkami [MPE]2 pro pozitivní tlak a odpařování.
Pro digesci se používá směs trypsin LysC a pro kvantifikaci peptidů Pierce Quantitative Fluorometric Peptide Assay.
Analytická separace probíhá na systému Evosep One s 21minutovou gradientní metodou (60 vzorků/den) a detekce na hybridním kvadrupól-Orbitrap Q Exactive HF-X.
Software Proteome Discoverer 2.4 slouží pro vyhledávání MS2 spekter v proteomové databázi s 1% FDR.
Optimalizace pipetovacích tříd zajistila přesnost <3% CV pro in-solution roztoky a <1% CV pro čistící pufry.
Pro ověření přesnosti 5µl pipetáže fluoresceinu byla vyvinuta QC skripta s CV <5% u 48 i 96 dělení.
Automatizovaná metoda dosahuje lepší výtěžnosti peptidů než manuální spin kolóny (80,7 vs 77,9 % pro celý workflow) a zkracuje dobu přípravy z 20 na 2,5 min na vzorek.
Reprodukovatelnost v rámci jedné destičky dosahovala 7,2% CV, mezi destičkami 8,6% CV u poolované séra a 20,4% CV u individuálních pacientských vzorků.
LC-MS/MS analýza ukázala stabilní identifikace 188 proteinových skupin s nízkými variacemi (<3,1% CV u významných parametrů).
Workflow umožňuje zpracovat až 96 vzorků za 4 hodiny s minimem manuálních zásahů a důkladnou QA/QC kontrolou.
Výsledný protokol je ideální pro velké kohortní studie, klinickou proteomiku a průmyslovou analytiku se zvýšenou reproducibilitou a efektivitou.
Workflow lze rozšířit o zásady multiplexního značení (TMT), frakcionaci peptidů i kombinovat s různými LC-MS platformami.
Automatizovaná QC skripta lze adaptovat pro další nutriční a biomarkerové studie.
Potenciální je i integrace na multi-omics pipeliny a klinické diagnostiky.
Prokázali jsme, že uHTPPP představuje robustní, rychlou a vysoce reprodukovatelnou automatizovanou přípravu vzorků plazmy a séra pro hmotnostní spektrometrii ve velkých populacích, s vylepšenou výtěžností peptidů a sníženou variabilitou.
LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS, LC/Orbitrap
ZaměřeníProteomika, Klinická analýza
VýrobceThermo Fisher Scientific
Souhrn
Význam tématu
Large-scale plasma proteomika vyžaduje spolehlivou, reprodukovatelnou a rychlou přípravu vzorků. Manuální postupy jsou časově náročné a mohou přidávat chybovost, což omezuje proveditelnost studií zahrnujících stovky až tisíce vzorků.
Cíle a přehled studie
Cílem práce je představit ultra vysokokapacitní workflow uHTPPP pro přípravu krevní plazmy a séra na platformě Hamilton Microlab STARLet s minimem manuálních zásahů a vysokou přesností, optimalizované pro translational proteomics velkých lidských populací.
Použitá metodika a instrumentace
Workflow je založen na komerčním Thermo Scientific EasyPep 96 MS Sample Prep Kit a Hamilton Microlab STARLet s modulárními jednotkami [MPE]2 pro pozitivní tlak a odpařování.
Pro digesci se používá směs trypsin LysC a pro kvantifikaci peptidů Pierce Quantitative Fluorometric Peptide Assay.
Analytická separace probíhá na systému Evosep One s 21minutovou gradientní metodou (60 vzorků/den) a detekce na hybridním kvadrupól-Orbitrap Q Exactive HF-X.
Software Proteome Discoverer 2.4 slouží pro vyhledávání MS2 spekter v proteomové databázi s 1% FDR.
Hlavní výsledky a diskuse
Optimalizace pipetovacích tříd zajistila přesnost <3% CV pro in-solution roztoky a <1% CV pro čistící pufry.
Pro ověření přesnosti 5µl pipetáže fluoresceinu byla vyvinuta QC skripta s CV <5% u 48 i 96 dělení.
Automatizovaná metoda dosahuje lepší výtěžnosti peptidů než manuální spin kolóny (80,7 vs 77,9 % pro celý workflow) a zkracuje dobu přípravy z 20 na 2,5 min na vzorek.
Reprodukovatelnost v rámci jedné destičky dosahovala 7,2% CV, mezi destičkami 8,6% CV u poolované séra a 20,4% CV u individuálních pacientských vzorků.
LC-MS/MS analýza ukázala stabilní identifikace 188 proteinových skupin s nízkými variacemi (<3,1% CV u významných parametrů).
Přínosy a praktické využití metody
Workflow umožňuje zpracovat až 96 vzorků za 4 hodiny s minimem manuálních zásahů a důkladnou QA/QC kontrolou.
Výsledný protokol je ideální pro velké kohortní studie, klinickou proteomiku a průmyslovou analytiku se zvýšenou reproducibilitou a efektivitou.
Budoucí trendy a možnosti využití
Workflow lze rozšířit o zásady multiplexního značení (TMT), frakcionaci peptidů i kombinovat s různými LC-MS platformami.
Automatizovaná QC skripta lze adaptovat pro další nutriční a biomarkerové studie.
Potenciální je i integrace na multi-omics pipeliny a klinické diagnostiky.
Závěr
Prokázali jsme, že uHTPPP představuje robustní, rychlou a vysoce reprodukovatelnou automatizovanou přípravu vzorků plazmy a séra pro hmotnostní spektrometrii ve velkých populacích, s vylepšenou výtěžností peptidů a sníženou variabilitou.
Použitá instrumentace
- Thermo Scientific EasyPep 96 MS Sample Prep Kit, EasyPep Mini MS Kit
- Hamilton Microlab STARLet s moduly [MPE]2
- Evosep One LC systém a EvoTip trapy
- Thermo Scientific Q Exactive HF-X Orbitrap MS
- Pierce Quantitative Fluorometric Peptide Assay, Invitrogen Fluorescein NIST-Traceable Standard
- Proteome Discoverer 2.4 software, UniProt databáze
Obsah byl automaticky vytvořen z originálního PDF dokumentu pomocí AI a může obsahovat nepřesnosti.
Podobná PDF
An Ultra High-throughput Plasma Protein Profiling (uHTPPP) Workflow Using a Modified Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer
2020|Thermo Fisher Scientific|Postery
An Ultra High-throughput Plasma Protein Profiling (uHTPPP) Workflow Using a Modified Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Michelle L. Dubuke1, Sarah Trusiak1, Sitara Chauhan1, Ryan D. Bomgarden2, Sergei Snovida2, Bhavin Patel2, Emily I. Chen1. 1Thermo Fisher Scientific, Precision Medicine Science Center, Cambridge, MA.…
Klíčová slova
serum, serumgroups, groupsdepleted, depletedpmsc, pmschamilton, hamiltonprotein, proteinspin, spinproteins, proteinsidentifications, identificationspeptide, peptideplasma, plasmaquantified, quantifiedhela, helarecovery, recoveryplate
High-throughput plasma proteomics: A standardized and scalable workflow for quantitative protein profiling in large sample cohorts
2019|Thermo Fisher Scientific|Aplikace
APPLICATION NOTE No. 73194 High-throughput plasma proteomics: A standardized and scalable workflow for quantitative protein profiling in large sample cohorts Keywords Q Exactive, Orbitrap, protein biomarker, plasma workflow, serum workflow, Evosep, high throughput proteomics workflow Authors Jing Wang1; Sarah Trusiak1;…
Klíčová slova
cancer, cancerhealthy, healthylung, lungplasma, plasmascaled, scaledevosep, evosepabundance, abundanceeasypep, easypepworkflow, workflowprotein, proteinpeptide, peptidegroups, groupsalt, altpatient, patientthroughput
Orbitrap Exploris 240 mass spectrometer delivers significantly increased lab productivity and reproducibility of human plasma proteome profiling from large human cohort studies
2021|Thermo Fisher Scientific|Ostatní
CASE STUDY 66002 Orbitrap Exploris 240 mass spectrometer delivers significantly increased lab productivity and reproducibility of human plasma proteome profiling from large human cohort studies “For large clinical cohort studies where hundreds of plasma samples are to be analyzed, a…
Klíčová slova
plasma, plasmauncg, uncggreensboro, greensborocarolina, carolinapmsc, pmscuhtppp, uhtppphundreds, hundredssamples, sampleshuman, humanprofiling, profilingcohort, cohortbiomedical, biomedicalreproducibility, reproducibilitylaboratory, laboratorynorth
Thermo Scientific™ Orbitrap Exploris™ 240 mass spectrometer - Plasma profiling–reliable large cohort analysis with a fully automated workflow
2020|Thermo Fisher Scientific|Technické články
Proof of performance Orbitrap Exploris 240 mass spectrometer Plasma profiling–reliable large cohort analysis with a fully automated workflow Summary Here we present an Ultra-High Throughout Plasma Protein Profiling (uHTPPP) workflow (Figure 1), from automated sample preparation to high-resolution, accurate-mass (HRAM)…
Klíčová slova
evosep, evosepexploris, explorisorbitrap, orbitrapone, oneuhtppp, uhtpppworkflow, workflowpeptide, peptidecohort, cohortsample, sampleautomated, automatedprotien, protienstarlet, starletprep, prepdipvpkpk, dipvpkpklsseapalfqfdlk
