Automated High-Throughput Data Processing for Targeted Multiplexed Insulin Analog Detection and Quantification

Význam tématu

V posledních letech roste potřeba rychlých a vysoce selektivních metod pro detekci a kvantifikaci peptidových hormonů, především inzulinu a jeho analogů. Nově vyvinuté inzulinové varianty s drobnými změnami sekvence vyžadují spolehlivé analytické postupy, které zvládnou jejich rozlišení v komplexních biologických matricích na nízkých koncentracích. Kombinace hromadné imunoafinitní extrakce (MSIA) s vysoce přesnou hmotnostní spektrometrií (HRAM) představuje inovativní přístup, jenž umožňuje dosáhnout vysoké citlivosti, selektivity a throughput potřebného pro rutinní i výzkumné aplikace.

Cíle a přehled studie

Studie prezentuje plně automatizovaný, multiplexní a vysokoprůtokový workflow pro simultánní detekci a cílenou kvantifikaci inzulinu a jeho analogů v rozmezí 1,5–960 pM v modelových a skutečných biologických matricích (PBS/BSA, lidská plazma). Hlavním cílem bylo ověřit schopnost metody rozlišit struktury velmi podobných peptidů, zajistit kvantitativní linearitu, reprodukovatelnost (<20 % RSD) a spolehlivost kvalifikačních parametrů na nejnižších koncentracích.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow sestával z následujících kroků a zařízení:

• Příprava vzorku: spiking známých koncentrací inzulinových analogů (Humulin S, Apidra, Lantus, NovoRapid, Hypurin Porcine) a interního standardu (porcinní inzulin) do PBS/BSA nebo lidské plazmy.
• Affinitní extrakce MSIA: použití Thermo Scientific™ MSIA™ D.A.R.T.’S s protilátkou anti-inzulin na automatizované platformě Thermo Scientific™ Versette™ (96kanálová hlava).
• Eluce peptidů a lyofilizace: eluční pufr s ACTH 1–24 v acetonitrilu/TFA, koncentrace ve Speed Vac™ a rekonkstituce ve formic acid/acetonitrilu.
• Chromatografie a detekce: Nano-LC na UltiMate™ 3000 RSLCnano systému s ProSwift™ RP-4H kolonou (1×250 mm, 50 °C), gradient 10–50 % acetonitrilu ve 0,1 % formic acid, následně HRAM detekce na Q Exactive™ (full-scan MS 70 000 FWHM, rozsah m/z 800–2 000, MS/MS 17 500 FWHM, inclusion list).
• Automatizovaná datová analýza: Thermo Scientific™ Pinpoint™ software (rev. 1.4) s extrakcí iontových chromatogramů pro 3–6 nejintenzivnějších izotopů na 3 nabité stavy, tolerance ±7 ppm, scoring na základě dot-produkt korelace teoretické/experimentální izotopové distribuce a rozložení nabitých stavů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Selektivita a rozlišení: HRAM MS umožnila při nízké koncentraci (1,5–960 pM) rozlišit ko-elutující inzulinové analogy díky přesným m/z hodnotám a plně vyřešeným izotopovým profilům.
• Linearita a citlivost: kvantifikační křivky měly regresní koeficient R2 > 0,98 (1/x weighting) pro všechny analogy a nabité stavy normalizované vůči porcinnímu inzulinu.
• Reprodukovatelnost: většina měření vykazovala %RSD < 20 % i na nejnižších úrovních (1,5 pM), hodnoty standardní odchylky dot-produkt korelace nad 0,8 od 3,75 pM výše.
• Rychlost a throughput: kompletní zpracování dat jednou workbookovou metodou v Pinpoint trvá ~30 minut pro více cílených analyz.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Simultánní a cílenou analýzu více inzulinových analogů v jednom běhu s minimálními maticovými interferencemi.
• Flexibilní post-acquisition analýzu dalších verzí inzulinu bez nutnosti opakovaného sběru dat.
• Vysokou automatizaci sample-preparation i zpracování dat, která podporuje vysoký laboratorní throughput a objektivní scoring kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření HRAM-based workflows pro jiné peptidové hormony a biologicky aktivní peptidy ve farmaceutickém vývoji i klinickém výzkumu. Integrace strojového učení pro pokročilou analýzu izotopových profilů, adaptivní optimalizace inkluzních listů a kombinace s HDX-MS či ion-mobility pro charakterizaci proteoform se jeví jako perspektivní směry. Metody lze také adaptovat pro monitorování terapeutických proteinů a biosimilars v reálných studijních vzorcích.

Závěr

Prezentovaný automatizovaný MSIA-HRAM workflow pro cílenou kvantifikaci inzulinu a jeho analogů nabízí vynikající selektivitu, citlivost a reprodukovatelnost i při sub-ng/mL koncentracích. Díky vysoké míře automatizace a flexibilitě v datové analýze je vhodný pro rutinní i výzkumné aplikace v biotechnologii a klinické farmaceutické analytice.

Reference

• Krastins B.; Prakash A.; Sarracino D. A. et al. Rapid development of sensitive, high-throughput, quantitative and highly selective mass spectrometric targeted immunoassays for clinically important proteins in human plasma and serum. Clinical Biochemistry 2013, 46(6), 399–410.
• Niederkofler E. E.; Phillips D. A.; Nedelkov D. et al. A universal mass spectrometric immunoassay (MSIA) model system based on human insulin-like growth factor 1 (IGF1). Application Note 1001, Thermo Fisher Scientific, 2013.
• Oran P. E.; Jarvis J. W.; Borges C. R.; Sherma N. D.; Nelson R. W. Mass spectrometric immunoassay of intact insulin and related variants for population proteomics studies. Proteomics Clinical Applications 2011, 5(7–8), 454–459.
• Couchman L.; Taylor D. R.; Moniz C. F.; Niederkofler E. E.; Ribar A.; Antwi K.; Kiernan U. A.; Krastins B.; Peterman S. MSIA insulin workflow for the comprehensive identification and analysis of isobaric insulins: a method for insulin mixture quantitation using HR/AM and multiplexed LC. Application Note 0614, Thermo Fisher Scientific, 2014.
• Peterman S. M.; Niederkofler E. E.; Phillips D. A.; Krastins B.; Kiernan U. A.; Tubbs K. A.; Nedelkov D.; Prakash A.; Vogelsang M. S.; Schroeder T.; Couchman L.; Taylor D. R.; Moniz C. F.; Vadali G.; Byram G.; Lopez M. F. An automated, high-throughput method for targeted quantification of intact insulin and its therapeutic analogs in human serum or plasma coupling mass spectrometric immunoassay with high resolution and accurate mass detection (MSIA-HR/AM). Proteomics 2014, 14(12), 1445–1456.