Reducing Sample Volume and Increasing Sensitivity for the Quantification of Human Insulin and 5 Analogs in Human Plasma Using ionKey/MS

Význam tématu

LC–MS/MS kvantifikace inzulinu a jeho analogů je klíčová pro vývoj nových léčebných režimů diabetu, validaci biosimilárních přípravků a monitorování farmakokinetiky. Tradiční ligandově-vazebné testy sice dosahují vysoké citlivosti, ale zápasí s omezenou specifičností, standardizací a schopností multiplexní analýzy. Mikroprůtokové systémy integrované v ESI zdroji nabízejí příležitost výrazně snížit spotřebu vzorku a rozpouštědel, zároveň zvýšit selektivitu a citlivost analýzy peptidů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo přenést existující analytickou metodu pro lidský inzulin a pět analogů z 2,1mm stupnice na systém ionKey/MS, dále snížit objem vycházejícího plazmového vzorku a zvýšit citlivost měření. Studie demonstruje adaptaci proteinové precipitace, SPE µElution a mikrofluidní chromatografie s trap/back elute strategií k dosažení LLOQ pod 50 pg/mL.

Použitá metodika a instrumentace

Analytická metoda kombinuje proteinovou precipitaci, extrakci na Oasis MAX 96-well µElution destičce a mikroproudovou UPLC se zpětným elucí z pasti.

• Proteinová precipitace (PPT) a SPE µElution pro selektivní izolaci inzulinů z 100 nebo 50 µL humaní plasmy.
• Trap/back flush konfigurace pro zvýšení objemu injekce a zúžení analytické zóny.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC M-Class s Trap Valve Manager pro at-column dilution a back elute
• ionKey/MS System s iKey Separation Device (150 µm × 100 mm, sub-2 µm částice, eCord interface)
• Xevo TQ-S triple quadrupole mass spectrometer se zdrojem ESI pozitive
• Oasis MAX 96-well µElution Plate pro SPE extrakci
• MassLynx 4.1 a TargetLynx pro řízení chromatografie, sběr dat a kvantifikaci

Hlavní výsledky a diskuse

• Metoda dosahuje LLOQ 25 pg/mL pro inzuliny glargine, lispro, glulisine, aspart a endogenní inzulin při 100 µL plasmy a 10 µL injekci (cca 41 amol na koloně).
• Snížení objemu vzorku na 50 µL stále umožňuje LLOQ 50 pg/mL pro většinu analogů.
• Porovnání s původní 2,1mm metodou ukazuje ~15× kumulativní zlepšení: 2,5× menší spotřeba vzorku, 3× nižší injekční objem a >2× vyšší citlivost.
• Šířky píků insulinů dosahují 3–4,2 s u základny, což zajišťuje dostatečné rozlišení i mezi velmi podobnými analoga lispro a endogenním inzulinem.
• Standardní křivky (25–10 000 pg/mL) vykazují linearitu R2 > 0,99, QC vzorky dosahují přesnosti 94–109 % a mezišaržové variability (CV) 3,4–8,8 %, splňující FDA doporučení.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné snížení spotřeby plasmového vzorku umožňuje více re‐analýz, dodržení ISR požadavků a vyšetřování citlivých pediatrických studií.
• Nižší spotřeba organických rozpouštědel (až 60× úspora) snižuje náklady a environmentální dopad.
• Metoda podporuje multiplexní kvantifikaci více inzulinů a analogů v jednom běhu, vhodné pro komplexní farmakokinetické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Mikroproudová UPLC integrovaná do zdroje MS se jeví jako perspektivní přístup pro analýzu dalších větších peptidů a proteinů, včetně biosimilárních a nově vyvíjených terapeutických biomolekul. Další rozvoj může směřovat ke zkratkám doby analýzy, automatizaci extrakce a použití vyšších parametrů multikontinuálních metod pro terapii diabetu i jiné biologické markery.

Závěr

Adaptace na ionKey/MS systémsní integraci přinesla významné zlepšení citlivosti a efektivity kvantifikace lidského inzulinu a pěti klíčových analogů. Metoda kombinuje mikroproudovou chromatografii, selektivní SPE a vysoce citlivou detekci, čímž otevírá cestu pro vysoce robustní bioanalytické aplikace ve farmaceutickém výzkumu a klinických studiích.

Reference

• Chambers E.E., Fountain K.J. Multidimensional LC-MS/MS Enables Simultaneous Quantification of Intact Human Insulin and 5 Recombinant Analogs in Human Plasma. Anal. Chem. 2014, 86(1), 694–702.
• Chambers E.E. et al. Development of a fast method for direct analysis of intact synthetic insulins in human plasma: the large peptide challenge. Bioanalysis 2012, 5(1), 65–81.
• Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. FDA, 2001.
• Bansal S., DeStafano A. Key elements of bioanalytical method validation for small molecules. AAPS J. 2007, 9(1), E109–E114.