Analysis of Polar and Ionic Drugs in Doping Control by Ion‑Exchange Chromatography with the Agilent 1260 Infinity II SFC System

Význam tématu

V dopingové kontrole a forenzní analýze představuje spolehlivá detekce a kvantifikace vysoce polárních a iontových látek, jako jsou konjugáty kyseliny gama-hydroxybutyrátové (GHB), jejich prekurzory a metabolity, zásadní výzvu. Tradiční HPLC a GC metodiky mají omezení při separaci těchto sloučenin, což může vést k nekonzistentním výsledkům. Superkritická fluidní chromatografie (SFC) v kombinaci s iontoměnnými fázemi nabízí vysoce ortogonální přístup a umožňuje dosáhnout lepší retence, separace a kvantifikace polárních i iontových analyzů.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje aplikaci systému Agilent 1260 Infinity II SFC se silně kationtoměnnou stacionární fází pro separaci a kvantifikaci sedmi klíčových analyzů (GBL, GHB, ETS, ETG, GHB-Gluc, Meld a G-BTB) v lidské moči. Cílem bylo vyvinout robustní SFC/MS/MS metodu, optimalizovat chromatografické a hmotnostně-spektrometrické parametry a porovnat dosažené limity detekce a kvantifikace s existujícími HPLC/MS metodami.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda vycházela z kombinace superkritického CO₂ a modifikátoru MeOH/H₂O (95/5, v/v) s aditivy (20 mM amonný formiát + 15 mM kyselina mravenčí). Gradient začínal na 15 % modifikátoru a během 1 min stoupal na 60 %, s navýšením průtoku z 2,0 na 2,5 mL/min. Pro optimalizaci retence a špičatosti analýz byly testovány různé množství vody, koncentrace aditiva, teplota kolony (25–55 °C) a back-pressure (90–170 bar), přičemž finálně byly zvoleny 45 °C a 170 bar.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity II SFC Control Module
• Agilent 1260 Infinity II SFC Binary Pump
• Agilent 1260 Infinity II SFC Multisampler
• Agilent 1260 Infinity II Diode Array Detector s vysokotlakou SFC kyvetou
• Agilent 1260 Infinity II Multicolumn Thermostat
• Agilent 6470A Triple Quadrupole LC/MS s Agilent Jet Stream

Hlavní výsledky a diskuse

Byla prokázána vynikající selektivita a stabilita retence pro všechny analyty ve spiked moči, bez interferencí na klíčových MRM tranzicích. Limity detekce (LOD) se pohybovaly od 0,001 do 0,5 mg/L a limity kvantifikace (LOQ) od 0,005 do 2,5 mg/L. Linearity překročila R² > 0,97 a relativní přesnosti ploch a retenčních časů byly pod 15 % a 1 %. Porovnání s HPLC/MS lze konstatovat, že navržená SFC/MS/MS metoda poskytuje srovnatelné, v mnoha případech lepší LOQ a LOQ nižší než standardní MRPL hodnoty.

Přínosy a praktické využití metody

Navržená metoda umožňuje rychlé (do 6 min) a spolehlivé měření polárních a iontových léčiv a metabolitů v biologických matricích s minimální přípravou vzorku. Díky vysoké citlivosti a selektivitě je vhodná pro dopingovou kontrolu, forenzní toxikologii a klinické studie, kde je klíčová nízká detekční hranice a robustnost analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodika SFC s iontoměnnými fázemi lze rozšířit o další třídy polárních a iontových látek, například aminokyseliny, peptidy či nové dopingové látky. Integrace s vysokorychlostními detektory a multi-dimenzionální chromatografií nabídne další posun v komplexních matricích. Dále se předpokládá vývoj univerzálních modulátorů pro širší škálu aditiv a pH stabilizačních prostředků.

Závěr

Studie potvrdila, že SFC v kombinaci se silně kationtoměnnou kolonu a MS/MS detekcí představuje efektivní alternativu k tradičním HPLC metodám pro analýzu vysoce polárních a iontových látek v biologických vzorcích. Metoda splňuje požadavky na citlivost, selektivitu a rychlost a otevírá nové možnosti pro aplikace v dopingové kontrole a forenzní analýze.

Reference

1. Par M.K. et al. SFC/MS as an Orthogonal Technique for Improved Screening of Polar Analytes in Anti-Doping Control. Anal. Bioanal. Chem. 2016, 408, 6789–6797.
2. Desfontaine V. et al. SFC–MS versus RPLC-MS for Drug Analysis in Biological Samples. Bioanalysis 2015, 7, 1193–1195.
3. Fujito Y. et al. Importance of Optimizing Chromatographic Conditions and Mass Spectrometric Parameters for Supercritical Fluid Chromatography/Mass Spectrometry. J. Chromatogr. A 2017, 1508, 138–147.
4. Novakova L. et al. Ultra High-Performance Supercritical Fluid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry for Screening of Doping Agents. Anal. Chim. Acta 2015, 853, 647–659.
5. Abanades S. et al. Gamma-Hydroxybutyrate (GHB) in Humans: Pharmacodynamics and Pharmacokinetics. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006, 1074, 559–576.
6. Mehling L.M. et al. GHB-O-β-Glucuronide in Blood and Urine is not a Suitable Tool for the Extension of Detection Window after GHB Intake. Forensic Toxicol. 2017, 35, 263–274.
7. Xhaferaj M. et al. Ion Exchange in Supercritical Fluid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (SFC-MS/MS): Application of Polar and Ionic Drugs and Metabolites in Forensic and Anti-Doping Control. J. Chromatogr. A 2020, 1614, 460726.
8. Albertmann M. et al. A High-Performance Liquid Chromatographic-Tandem Mass Spectrometric Method for the Determination of Ethyl Glucuronide and Ethyl Sulfate in Urine Validated According to Forensic Guidelines. J. Chromatogr. Sci. 2012, 50, 51–56.
9. Kim Y. et al. Method for Screening and Confirming Meldonium in Human Urine by High-Resolution Mass Spectrometry and Identification of Endogenous Interferences for Anti-Doping Testing. Mass Spectrom. Lett. 2017, 8, 39–43.
10. World Anti-Doping Agency. Technical Document TD2016EAAS. WADA, 2015.
11. Brailsford A.D. et al. Pharmacokinetic Properties of Gamma-Hydroxybutyrate (GHB) in Whole Blood, Serum and Urine. J. Anal. Toxicol. 2012, 36, 88–95.
12. World Anti-Doping Agency. Minimum Required Performance Levels for Detection and Identification of Non-Threshold Substances – TD2018MRPL, 2018.