Analysis of 17-Hydroxyprogesterone in Serum for Clinical Research

Význam tématu

17-hydroxyprogesteron (17-OHP) patří mezi klíčové glukokortikoidní steroidy, jehož stanovení je zásadní pro diagnostiku i výzkum poruch kortikálního steroidního metabolismu. Přesná a citlivá analýza 17-OHP přispívá k lepšímu sledování pacientů s kongenitální adrenální hyperplazií, ale i k výzkumu endokrinních onemocnění, kde imunochemické metody narážejí na křížové reakce a nízké selektivity.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout vysoce selektivní a citlivou metodu pro kvantifikaci 17-OHP v séru s minimálním objemem vzorku (100 µL) vhodnou pro klinický výzkum a vysoký průtok vzorků. Studie hodnotila extrakci pomocí Oasis PRiME HLB µElution technologie, automatizaci vzorkování, chromatografickou separaci na UPLC HSS T3 kolonce a detekci pomocí LC-MS/MS. Dále byla ověřena přesnost metody porovnáním s EQA vzorky.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC I-Class (FTN) s předsystémem HSS T3 VanGuard
• ACQUITY UPLC HSS T3 kolona, 1,8 µm, 2,1 × 50 mm
• Xevo TQD tandemový hmotnostní spektrometr
• Oasis PRiME HLB µElution Plate
• Tecan Freedom EVO® 100/4 pro automatizaci extrakce
• MassLynx™ a TargetLynx™ softwarový balík pro sběr a zpracování dat

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky séra byly doplněny stabilně značeným interním standardem (17-OHP-13C3) a precipitovány metanol-vodnou směsí. Extrakce probíhala na Oasis PRiME HLB µElution destičce s dvojím oplachem kyselinou/formamidou a amoniakálním roztokem v methanolu. Eluce byla realizována 45 µL methanolu následovaného 55 µL vody. Chromatografie využívala gradientní eluci (0,6 mL/min, 4,7 min) s mobilními fázemi voda s 2 mmol/l acetátu amonného a 0,1 % kyselinou mravenčí vs. methanol s identickým přídavkem. Detekce v režimu MRM pozitivní ESI ionizací sledovala prekurzorový ion m/z 331,2 a dva produktové ionty (97,0; 109,0).

Hlavní výsledky a diskuse

• Selektivita: bez interferencí z 11 strukturálně podobných steroidů, baseline separace 17-OHP a izobaru 21-hydroxyprogesteronu
• Citlivost: kvantifikace spolehlivá při 0,76 nmol/L (S/N > 10:1)
• Precision: celková CV 4,5–8,2 % napříč QC úrovněmi (1,5; 30; 227 nmol/L), opakovatelnost CV ≤ 8,2 %
• Lineárnost: rozsah 0,68–333 nmol/L, r2 > 0,994
• Matrix efekt: průměrný faktor 0,92–0,96, normalizovaný na interní standard minimalizoval iontové potlačení
• Shoda s EQA: Demingova regrese y = 0,93x + 0,14, r = 0,998, průměrná bias –5,0 %

Přínosy a praktické využití metody

• Nízký požadovaný objem séra (100 µL) šetří vzorky
• Vysoká selektivita a citlivost odstraňují chyby způsobené křížovými reakcemi
• Automatizace zvyšuje průtok a snižuje riziko lidské chyby
• Metoda je vhodná pro rutinní klinický výzkum a EQA programy

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření na multiplexní steroidní panely s dalšími koenzymy a hormony, integrace do laboratorních informačních systémů s využitím strojového učení pro lepší kontrolu kvality, miniaturizace SPE formátů pro vyšší výtěžnost a potenciální aplikace v bod-of-care diagnostice.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda pro stanovení 17-OHP kombinuje vysokou citlivost, selektivitu a automatizaci, čímž poskytuje spolehlivý nástroj pro klinický výzkum a rutinní kontrolu kvality. Validace prokázala vynikající analytické parametry i shodu s externími referencemi.

Reference

• Foley D., Wills M., Calton L. Analysis of Testosterone, Androstenedione, and Dehydroepiandrosterone Sulfate for Clinical Research. Waters Application Note. 2016. 720005554EN.