BIOSEPARATIONS - APPLICATIONS NOTEBOOK

Význam tématu

V biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu hrají bioterapeutika klíčovou roli díky své vysoké specificitě a účinnosti. S růstem využití monoklonálních protilátek, proteinových konjugátů a dalších makromolekul v léčbě roste i potřeba spolehlivých analytických metod pro sledování jejich čistoty, bezpečnosti a stability.
Charakterizace proteinových agregátů a drobnějších fragmentů je kritická pro zajištění kvality a účinnosti finálního produktu. Velmi důležitou roli zde hraje velikostně-exkluzní chromatografie (SEC), která umožňuje oddělení biomolekul na základě jejich hydrodynamického poloměru. S nástupem UltraPerformance LC (UPLC) technologií a sub-2-µm částic se zvýšila rozlišovací schopnost, citlivost i průchodnost vzorků, což výrazně zrychluje vývojové a kontrolní procesy.

Cíle a přehled studie / článku

Ve shrnutém obsahu je představeno několik klíčových aplikací a metodických pokynů:

• Optimalizace pufrů a automatizace přípravy mobilní fáze (Auto•Blend Plus) za účelem konstantního pH a iontové síly v SEC
• Přenos a škálování metod mezi tradičními HPLC a moderními UPLC systémy
• Vývoj a porovnání nových 450Å BEH SE-UPLC kolon pro analýzu makromolekul až do ~2 MDa
• Protokoly pro SEC–MS při ne-denaturačních podmínkách umožňující přesné stanovení molekulové hmotnosti intactních biomolekul a fragmentů
• Doporučení pro zásadní parametry metodického vývoje: iontová síla, pH, průtok a délka kolony

Použitá metodika a instrumentace

V uvedených aplikacích byly nasazeny následující technologie a přístroje:

• Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio System s nízkodisperzními kapalinovými cestami
• Kolony BEH200 SEC (200Å, 1,7 µm) a BEH450 SEC (450Å, 2,5 µm) pro UPLC
• XBridge Protein BEH SEC kolony (200Å, 3,5 µm a 450Å, 3,5 µm) pro HPLC
• Quaternary Solvent Manager s Auto•Blend Plus™ pro mísení pufrů na bázi fosfátů a chloridu sodného
• ACQUITY UPLC Tunable UV detektor, Alliance HPLC TUV, Empower 3 Software
• Xevo G2 Q-Tof se softwary MassLynx a MaxEnt pro SEC–MS analýzu intactních proteinů

Hlavní výsledky a diskuse

1. Stabilita a reprodukovatelnost BEH450 SEC kolony
– Pět sloupců z různých výrobních šarží vykázalo RSD retenčních časů <0,02 min pro majoritní standardy až do 1,8 MDa.
– Při více než 800 injekcích zůstaly retenční časy thyroglobulinu stabilní a asymetrie uracilu na konstantní úrovni.
2. Vliv mobilní fáze na sekundární interakce
– Ionická síla 50–250 mM NaCl neměla vliv na kalibrační křivku (R²>0,99).
– Zvýšení NaCl zlepšilo tvar a symetrii píků mAb (USP Tailing z 1,64→1,22) a zvýšilo pozorovaný podíl agregátů z ~1 % na ~5 %.
– pH 6,0–7,6 neměnilo významně retenční časy standardů.
3. Efekt velikosti částic
– SE-UPLC BEH450 (2,5 µm) poskytla dvojnásobné rozlišení apoferritinu (443 kDa) oproti HPLC (8 µm), Rs=2,49 vs. 1,42.
4. Rozšíření rozsahu molekulových hmotností
– BEH200 (200Å) optimální do ~150 kDa, BEH450 (450Å) nad ~450 kDa.
– Kombinací BEH200+BEH450 (150 + 150 mm) v sérii se dosáhne lineární pseudo rozsah od 10 kDa do >1 MDa.
5. SEC–MS pod ne-denaturačními podmínkami
– Volitelný pufr 100 mM NH₄COOH + 25 mM fosfátu umožňuje ne-denaturační SEC s přidanou modulací FA/ACN před ESI.
– Myoglobin (monomer, dimer) a intactní mAb (150 kDa) byly detekovány v nativní asociaci s identifikací fragmentů (47–101 kDa).

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizace přípravy pufrů zaručuje stabilní pH/iontovou sílu pro rutinní QC
• Sub-2-µm BEH kolony na UPLC systémech zkracují analýzy 3–35 min na 1–4 min
• Možnost snadného přenosu metod mezi HPLC a UPLC (scale-up/down)
• Rozšíření MD‐rozsahu umožňuje sledovat vysokomolekulární agregáty až do ~2 MDa
• On-line SEC–MS pod ne-denaturačním režimem poskytuje přesné stanovení intactní hmotnosti molekul a identifikaci fragmentů bez offline desaltu

Budoucí trendy a možnosti využití

1. Integrace SEC se sekundárními technikami (MS/MS, MALS, AUC) pro komplexní charakterizaci heterogenity a glykozylace.
2. Vývoj multidimenzionální chromatografie (2D-LC) spojující IEX / HILIC / RPLC pro detailní peptid mapping.
3. Rozšíření automatizace a robotizace přípravy vzorků (glykanové, aminokyselinové analýzy) a zkvalitnění datové informatiky (AI-poháněné zpracování dat).
4. Využití nových stacionárních fází (CSH, Wide-Pore HILIC) pro stabilnější a citlivější rozluštění proteinových modifikací.

Závěr

S moderními ACQUITY UPLC kolony založenými na BEH technologii a nízkodisperzními systémy lze realizovat vysoce reprodukovatelné, rychlé a citlivé SEC analýzy biomolekul od malých proteinů až po vysoko-molekulární agregáty. Díky podpoře čtyř-kanálového míchání pufrů Auto•Blend Plus, možnosti přenosu metod mezi HPLC/UPLC a přímé kombinaci SEC–MS pod ne-denaturačními podmínkami získává analytická laboratoř silný nástroj pro komplexní charakterizaci bioterapeutik od raného vývoje až po kontrolu kvality.

Reference

1. Porath J., Flodin P. Gel filtration: a method for desalting and group separation. Nature. 1959;183:1657–9.
2. Hong P., Koza S., Fountain K.J. Analysis of biomolecules by size-exclusion UltraPerformance LC. Waters Application Note WA64226. 2010.
3. Gritti F., Guiochon G. On the extra-column band-broadening contributions of modern UHPLC. J. Chrom. A. 2010;1217(49):7677–7689.
4. Ricker R.D., Sandoval L.A. Fast, reproducible SEC of biological macromolecules. J. Chrom. A. 1996;743(1):43–50.
5. García M.C. Effect of mobile phase additives on sensitivity in protein LC–MS. J. Chrom. B. 2005;825:111–23.
6. Liu H., Gaza-Bulseco G., Chumsae C. Analysis of reduced mAbs using SEC–MS. JASMS. 2009;20:2264.
7. Chakraborty A., Chen W., Mazzeo J. Butyl-based UPLC–SEC/UV/MS for reduced mAbs. Waters Application Note 720004018EN. 2011.