Cursory Analysis of Nucleic Acid Components in Adeno-Associated Virus (AAV) Samples Using Anion-Exchange Chromatography (AEX)

Význam tématu

Rekombinantní adeno-asociovaný virus (AAV) je klíčovým nosičem genové terapie. Kontrola integrity genomu a přítomnosti volných nukleových kyselin je zásadní pro zajištění bezpečnosti a účinnosti AAV přípravků. Metody jako agarózová elektroforéza nabízejí omezenou přesnost, zatímco aniontová výměnná chromatografie (AEX) přináší robustní, kvantitativní a snadno automatizovatelný přístup.

Cíle a přehled studie

Studie představuje novou AEX metodu s použitím Protein-Pak Hi-Res Q Column pro detekci neobaleného genomového materiálu a posouzení integrity AAV genomu. Analýza byla prováděna na nativních i proteinázou K digešovaných vzorcích, aby se identifikovaly špičky odpovídající volným nukleovým kyselinám.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class Bio systém
• ACQUITY UPLC TUV detektor s titanovou flow cell
• Protein-Pak Hi-Res Q Column
• Empower 3 software pro správu dat

Použitá metodika

Vzor AAV9-CamkIIa-GFP (titer 1,61×10^14 GC/mL) byl digešován proteinázou K (56 °C, 2 h). Separace probíhala při 30 °C na sloupci Protein-Pak Hi-Res Q s mobilními fázemi: 20 mM Tris pH 7,4 a lineární gradient TMAC až do 2300 mM během 10 minut. Detekce UV při 260 a 280 nm umožnila rozlišení nukleových kyselin od proteinových komponent.

Hlavní výsledky a diskuse

Po digeši proteinázou K došlo k významnému poklesu špičky obaleného kapsidu (retence 6–8 min) a vzniku dvou hlavních špiček při 13–15 min s A260/A280 ~1,8. Toto naznačuje čistý ssDNA materiál. Snížení A260/A280 v oblasti kapsidu na ~0,9 potvrzuje degradaci kapsidových proteinů. Další analýzy CDMS potvrdily identitu uvolněného ssDNA. Empty kapsidy bez genomu nevykazovaly odpovídající špičku v oblasti volné DNA.

Přínosy a praktické využití metody

• Robustní a reprodukovatelná separace AAV komponent
• Kvantitativní stanovení neobaleného genomu i integrity kapsidu
• Nízká spotřeba vzorku a snadná automatizace
• Možnost izolace frakcí pro následné analýzy

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se, že AEX metody budou dále optimalizovány pro vysoce průtokové platformy v QA/QC. Integrace s vysokorozlišujícím MS či CDMS může umožnit detailní charakterizaci genomu a kontaminantů. Rozšíření na jiné virusové vektory a vysoce přesné metody stanovení množství genomu posílí průmyslové standardy.

Závěr

Preliminární výsledky potvrzují, že AEX na Protein-Pak Hi-Res Q umožňuje efektivní rozlišení kapsid, proteinů a volného ssDNA. Metoda nabízí perspektivu rutinní kontroly integrity AAV genomu a detekce volných nukleových kyselin v nativních vzorcích.

Reference

1. Hajba L a Guttman A. Recent Advances in the Analysis of Full/Empty Capsid Ratio and Genome Integrity of Adeno-associated Virus Gene Delivery Vectors. Current Molecular Medicine 2020;20:1–8.
2. Yang H, Koza S, Chen W. Anion-Exchange Chromatography for Determining Empty and Full Capsid Contents in Adeno-Associated Virus. Waters Application Note 2021;720006825.
3. Yang H, Koza S, Chen W. Plasmid Isoform Separation and Quantification by Anion-Exchange Chromatography (AEX). Waters Application Note 2021;720007207.
4. Yang H, Koza S, Chen W. Separation and Size Assessment of dsDNA Fragments by Anion-Exchange Chromatography (AEX). Waters Application Note 2021;720007321.
5. Yang H, Koza S, Yu YQ. Size and Purity Assessment of Single-Guide RNAs by Anion-Exchange Chromatography (AEX). Waters Application Note 2021;720007428.
6. Werling NJ, Satkunanathan S, Thorpe R, Zhao Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Human Gene Therapy Methods 2015;26:82–92.
7. Ai J, Ibraheim R, Tai PWL, Gao G. A Scalable and Accurate Method for Quantifying Vector Genomes of Recombinant Adeno-Associated Viruses in Crude Lysate. Human Gene Therapy Methods 2017;28(3):139–147.