Determination of Nitrosamines in Active Pharmaceutical Ingredients

Význam tématu

Stanovení nitrosaminů v aktivních farmaceutických látkách je klíčové z hlediska bezpečnosti léků, neboť tyto genotoxické nečistoty mohou představovat riziko karcinogeneze i při velmi nízkých koncentracích. Regulace ze strany FDA a EMA proto vyžaduje citlivou analýzu na úrovni jednotek ng/mL, aby byla zajištěna compliance s limitem 1,5 µg GTI na denní dávku.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo ukázat schopnost kombinace vysokotlaké kapalinové chromatografie Agilent 1260 Infinity II Prime LC a trojitě kvadrupólového hmotnostního analyzátoru Ultivo LC/TQ pro stanovení typických nitrosaminů (NDMA, NMor, NMEA, NPyr, NDEA, NPip, NDPA, NDBA) v modelové matrici valsartanu. Studie hodnotila limity detekce (LOD), kvantifikace (LOQ), linearitu, přesnost a opakovatelnost při koncentracích v rozmezí 0,25–200 ng/mL.

Použitá metodika a instrumentace

Pro chromatografii byly použity následující přístroje a podmínky:

• Agilent 1260 Infinity II Prime LC (čerpadlo až 800 bar, kvaternární míchání),
• Agilent 1260 Infinity II Multisampler a Multicolumn Thermostat pro přesné uchování teploty kolony,
• Kolona Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD (2,1 × 100 mm, 1,8 µm),
• Mobile fáze: voda + 0,1 % formiová kyselina (A), methanol + 0,1 % formiová kyselina (B), acetonitril + 0,1 % formiová kyselina (C),
• Gradientní módy: rychlý cyklus 6 min (15→95 % B) a prodloužený eluce ostatních látek (Gradient 2),
• Agilent Ultivo LC/TQ s APCI zdrojem, MRM/DMRM režim, optimalizované fragmentace a kolizní energie pro každou nitrosaminu,
• Software Agilent MassHunter pro sběr dat, kvalitativní a kvantitativní zpracování.

Příprava vzorku spočívala ve vyřešení 80 mg valsartanu ve 20 mL methanolu, přidání směsi nitrosaminů a vytvoření kýžené koncentrace 50 ng/mL. Kalibrace probíhala v hladinách 1, 2, 10, 20, 100 a 200 ng/mL.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografické rozlišení pro osm nitrosaminů bylo dosaženo v časech retence 0,99–5,31 min, s vynikající linearitou (R2 > 0,999) a malou variabilitou retenční doby (RSD ≤ 0,41 %). LOQ se pohybovalo od 0,25 do 5 ng/mL, LOD byl typicky pod 0,7 ng/mL. Přesnost stanovení (RSD plochy) byla lepší než 3 % při 10 ng/mL. Recoverie ve valsartanovém vzorku dosáhly 93–100 %, s výjimkou NDBA, kde cca 82 % naznačilo potlačení signálu v APCI zdroji. K odstranění přebytku matrice se doporučuje proplach kolony organickými složkami po analýze.

Přínosy a praktické využití metody

Navržená metoda nabízí vysokou citlivost i v přítomnosti složitých farmaceutických matric. Díky robustnímu čerpadlu lze využít sub-2 µm kolony pro zkrácení doby analýzy a zvýšení propustnosti laboratoře, zároveň nízké náklady na údržbu a jednoduchá úprava gradientu umožňují široké nasazení v QA/QC i výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace vysoce rozlišovací hmotnostní spektrometrie (HRMS) pro přesnější identifikaci nečekaných nečistot,
• Automatizace vzorkování a zpracování dat s využitím strojového učení pro prediktivní modely potlačení iontů,
• Rozšíření panelu analyzovaných genotoxických látek a adaptace metody pro nové farmaceutické sloučeniny.

Závěr

Metoda kombinující Agilent 1260 Infinity II Prime LC a Ultivo LC/TQ dosahuje požadované citlivosti pro stanovení nitrosaminů pod hranici 1,5 µg/denní dávku, s vysokou opakovatelností a přesností. Systém nabízí ideální poměr výkonu, flexibility a nákladů, což podpoří bezpečnost a kontrolu kvality ve farmaceutickém průmyslu.

Reference

1. EMA. CH guideline M7(R1) on assessment and control of DNA reactive (mutagenic) impurities in pharmaceuticals. August 2015 (EMA/CHMP/ICH/83812/2013).
2. Masada S. et al. Rapid and Efficient HPLC Analysis of NDMA Impurity in Valsartan. Scientific Reports 2019;9:11852.
3. FDA. LC-HRMS Method for Determination of Six Nitrosamine Impurities in ARB Drugs. May 21, 2019.