Sensitive Native Mass Spectrometry of Macromolecules Using Standard Flow LC/MS

Význam tématu

Native hmotnostní spektrometrie (MS) nabízí jedinečnou možnost studovat intactní bílkoviny a jejich nekovalentní komplexy v přirozených podmínkách bez narušení jejich konformace. V biotechnologii a farmaceutickém vývoji je klíčová pro charakterizaci protein–protein interakcí, protein–ligand vazeb, struktury komplexů a vlastností terapeutických protilátek a konjugátů. Standardní LC/MS přístup přináší vyšší robustnost a reprodukovatelnost než tradiční nanoESI, což usnadňuje rutinní analýzy v biochemických laboratořích.

Cíle a přehled studie

Autoři si stanovili za cíl vyvinout citlivou, rychlou a reprodukovatelnou metodu LC/MS pro analýzu intactních proteinů a jejich nekovalentních komplexů při standardním analytickém průtoku. Studie demonstruje workflow založené na:

• Agilent 1290 Infinity II LC s AdvanceBio SEC kolonkou
• 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF systému se SWARM autotune a rozšířeným rozsahem až do m/z 30 000
• BioConfirm softwaru pro vyhodnocení výsledků

Použitá metodika a instrumentace

Pro zachování nativní struktury proteinů bylo používáno 100 mM roztoku ammonium acetátu (pH 7) a průtok 0,2 mL/min. Před online separací Bio-Spin kartáče pro desalting a výměnu pufru (6 kDa a 40 kDa mezní velikost) odstraňují nekompatibilní soli. LC provoz probíhá izokraticky 5 minut na SEC AdvanceBio guard kolonce (4,6 × 30 mm, 200 Å, 1,9 μm) při 4 °C nebo pokojové teplotě. MSD parametry zdroje Agilent Jet Stream jsou optimalizovány pro zachování nekovalentních interakcí a vysokou citlivost.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II high-speed pump, multisampler, multicolumn thermostat
• Agilent AdvanceBio SEC guard kolonka 4,6 × 30 mm, 200 Å, 1,9 μm
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF se SWARM autotune
• Agilent Jet Stream ionizační zdroj
• MassHunter Acquisition B.09.00, Qualitative Analysis 10.0, BioConfirm 10.0

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované podmínky pro 100 mM ammonium acetát eliminují agregaci a zlepšují reprodukovatelnost native MS: myoglobin zachoval holomyoglobinový stav s dominantními 9+ až 5+ náboji, ADH (tetramer) vykázal vyšší stabilitu ve srovnání s ammonium formátem. U intactních mAb (NISTmAb, trastuzumab) bylo dosaženo jasně odděleného náboje 15+–30+ a přesnosti hmotností v řádu jednotek ppm. Analýza ADC T-DM1 potvrdila průměrné DAR 3,5 v souladu s výrobcem. Systém úspěšně detekoval i velké komplexy: pyruvát kinázu (232 kDa), glutamát dehydrogenázu (335 kDa) a β-galaktosidázu (466 kDa) v rozsahu m/z až 14 000–15 000.

Přínosy a praktické využití metody

• Robustní, rychlá separace intactních proteinů a komplexů při standardním průtoku bez nanoESI potíží
• Vysoká citlivost a přesnost hmotností pro monomery, oligomery, mAb a ADC
• Možnost v rutinní QC a R&D laboratoři pro charakterizaci terapeutických proteinů

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj native LC/MS může zahrnovat:

• Integraci s iontovou mobilitou pro detailní prostorové mapování proteinových komplexů
• Automatizované high-throughput platformy pro screening interakcí
• Propojení s top-down proteomikou pro detailní stanovení proteoform
• Širší použití v charakterizaci bispecifických protilátek, glykoanalýze a monitoringu stability formulací

Závěr

Studie prokázala, že standardní průtoková LC/MS se 1290 Infinity II a 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF nabízí citlivou a spolehlivou platformu pro native MS intactních proteinů a jejich komplexů. Workflow je snadno implementovatelné v komerčních laboratořích a napomáhá přesné QC a výzkumu proteinových terapeutik.

Reference

1. Heck A.J. Nat. Methods 2008, 5, 927–933.
2. Freeke J., Robinson C.V., Ruotolo B.T. Int. J. Mass Spec. 2010, 298, 91–98.
3. Schachner L.F., Kelleher N.L. JASMS 2019, 30, 1190–1198.
4. Konermann L., Rosell F.L., Mauk A.G., Douglas D.J. Biochemistry 1997, 36(21), 6448–6454.
5. Wong D.L. Agilent application note 5991-7813EN, 2017.