Mass Spectrometric Characterization of Antibody-siRNA Conjugates using the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q‑TOF

Význam tématu

Small interfering RNA (siRNA) terapeutika představují perspektivní třídu léčiv založených na genové interferenci. Pro efektivní dodání siRNA do cílových buněk se často využívají monoklonální protilátky (mAb) jako doprava­telská vozidla. Charakterizace kovalentně vázaných mAb-siRNA konjugátů je kritická v průběhu vývoje a výroby biologických léčiv, neboť ovlivňuje stabilitu, účinnost a kvalitu konečného produktu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit nový LC/MS postup pro analýzu nativních intactních mAb-siRNA konjugátů. Práce využila systém Agilent 1290 Infinity II LC v kombinaci s AdvanceBio SEC kolónou, detekci na Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF se SWARM autotune a software MassHunter BioConfirm. Studie ukazuje postup přípravy vzorku, chromatografického rozdělení a hmotnostní spektrometrie pod denaturujícími i nativními podmínkami.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický workflows se skládá z následujících kroků:

• Příprava: částečná redukce mAb, navázání SMCC linkeru na volné thioly a konjugace s aktivovanou siRNA
• Čištění: aniontová výměnná chromatografie k oddělení neporažených reaktantů a výtažku DAR1 frakce
• Denaturující LC/MS: reverzní fáze PLRP-S kolona s gradientním eluce do acetonitrilu a 0,1 % kyseliny mravenčí, Agilent 6545XT Q-TOF v rozsahu m/z 300–8000
• Nativní LC/MS: SEC kolona AdvanceBio (300 mm) isokraticky s 100 mM amonným acetátem, Agilent 6545XT Q-TOF v rozšířeném rozsahu m/z až do 10 000

Hlavní instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity II LC (High-Speed Pump, Multisampler, Thermostat)
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF se zdrojem Jet Stream
• Software MassHunter LC/MS Data Acquisition a BioConfirm

Hlavní výsledky a diskuse

Denaturující analýza odhalila rozsáhlou disociaci konjugátů na lehké a těžké řetězce, což ukazuje na štěpení disulfidových vazeb při organicko-kyselém prostředí. Nativní SEC LC/MS metoda však dokázala zachovat konjugáty v nativní podobě. Pro vzorek DAR1 byly identifikovány dva hlavní nativní proteoformy: mAb-siRNA s jedním „cap“ usměrňovačem a variantu s třemi „cap“ modifikacemi. Rozlišení těchto forem na SEC kolóně a přesná dekonvoluce hmotností (< 5 ppm) potvrzují vysokou selektivitu a citlivost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá nativní LC/MS analýza umožňuje:

• Spolehlivou charakterizaci intactních mAb-siRNA konjugátů bez štěpení vazeb
• Kvantitativní rozlišení proteoform v závislosti na počtu připojených siRNA
• Optimalizaci výrobních procesů a kontrolu kvality v GMP prostředí

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření metody na další typy biokonjugátů (např. protilátky-léková činidla, protilátky-peptidové konjugáty) včetně multiplexního screeningu. Integrace s HDX-MS a ion mobility spektrometrií pro hlubší porozumění strukturní dynamice konjugátů. Využití vysokokapacitních automatizovaných systémů pro rychlou kontrolu výrobních šarží.

Závěr

Nový LC/MS protokol s nativním SEC rozdělením a Q-TOF detekcí umožňuje detailní studium intactních mAb-siRNA konjugátů, zachovává jejich nativní stav a nabízí vysokou přesnost měření hmotností. Metoda má významný dopad na vývoj a kontrolu biologických léčiv.

Reference

1. Fire A et al. Potent and Specific Genetic Interference by Double-Stranded RNA in Caenorhabditis elegans Nature 1998 391 806–811
2. Crooke ST et al. RNA-targeted therapeutics Cell Metab 2018 27(4) 714–739
3. Cuellar TL et al. Systematic evaluation of antibody-mediated siRNA delivery using an industrial platform of THIOMAB-siRNA conjugates Nucleic Acids Res 2015 43(2) 1189–1203
4. Sugo T et al. Development of antibody–siRNA conjugate targeted to cardiac and skeletal muscles J Control Release 2016 237 1–13
5. Sensitive Native Mass Spectrometry of Macromolecules Using Standard Flow LC/MS Agilent Technologies Application Note 5994-1739EN 2020
6. Precise Characterization of Intact Monoclonal Antibodies by the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF Agilent Technologies Application Note 5991-7813EN 2017